早幼粒白血病在银屑病病人外周血淋巴细胞中的表达及其与p53和bcl-2家族的相关性

彭世光 李 娜 蓝祖连 李 莉 何焱玲

(首都医科大学附属北京朝阳医院皮肤科，北京 100020)

·皮肤病性病诊疗与研究·

早幼粒白血病在银屑病病人外周血淋巴细胞中的表达及其与p53和bcl-2家族的相关性

彭世光 李 娜 蓝祖连 李 莉 何焱玲*

(首都医科大学附属北京朝阳医院皮肤科，北京 100020)

目的研究早幼粒白血病(promyelocytic leukaemia，PML)、p53、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，bcl-2)和bcl-2相关X蛋白(bcl-2 associated X protein，bax)在银屑病外周血淋巴细胞中的表达，并评估上述因子之间的相关性。方法分离25例银屑病病人和20例健康对照的外周血淋巴细胞，通过qRT-PCR和流式细胞学分别检测PML、p53、bcl-2和bax在外周学淋巴细胞中mRNA和蛋白的表达水平。采用Pearson相关性分析评估PML与上述因子之间的相关性。结果与健康对照相比，银屑病病人外周血淋巴细胞中PML和p53的mRNA及蛋白表达增加，bcl-2的mRNA及蛋白表达下降，bax的mRNA表达下降但蛋白表达增加。PML蛋白表达与p53、bcl-2以及bax蛋白表达呈相关性。结论PML可能参与了银屑病发病过程。

早幼粒白血病；银屑病；p53；Bcl-2家族；凋亡

银屑病是一种慢性、自身免疫性、复发性、炎性反应、系统性皮肤病。其特征性病理表现为表皮过度增生及分化异常，真皮及表皮炎性细胞浸润以及真皮毛细血管扩张[1]。尽管银屑病的发病机制尚未完全清楚，目前认为T细胞，尤其是T辅助细胞(T help cell, Th)1/Th17在银屑病发病中具有重要作用[2]。细胞生长与凋亡之间的平衡对于维持机体正常功能尤为重要。如果该平衡失衡，将可能出现细胞增生甚至诱导肿瘤出现。研究[3]提示银屑病具有并发恶性肿瘤高风险，尤其是血液系统恶性肿瘤。银屑病角质细胞存在凋亡耐受，部分治疗尤其是紫外线光疗，其治疗效果部分依赖于诱导皮肤淋巴细胞凋亡[4]。但银屑病外周血中淋巴细胞凋亡特征目前尚不清楚。

早幼粒白血病(promyelocytic leukaemia，PML)基因位于急性早幼粒白血病t(15：17)转位，PML基因在许多异常增生性疾病中对细胞生长和增生具有负向调节作用[5]。PML蛋白在细胞亚核巨分子中特征性地聚集形成PML-核体(PML-nuclear bodies，PML-NBs)，与多种细胞因子包括p53和B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，bcl-2)家族相互反应，从而调节细胞凋亡[6-7]。

目前对银屑病细胞凋亡的研究多集中在角质形成细胞领域，而银屑病外周血淋巴细胞中PML、p53和bcl-2家族的表达情况尚不清楚。在本研究中检测银屑病外周血淋巴细胞中PML、p53、bcl-2和bcl-2相关X蛋白(bcl-2 associated X protein，bax)的mRNA和蛋白表达水平，并评估上述蛋白表达间的相关性，以期研究PML在银屑病发病中可能发挥的作用。

1 对象与方法

1.1研究对象

25例寻常性银屑病病人和20例健康对照被纳入本研究。其中，寻常性银屑病病人中男性15例，女性10例；健康对照组男性12例，女性8例。寻常性银屑病病人和健康对照组平均年龄分别为(43.26±8.34)岁和(42.78±7.96)岁，2组人群性别及年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)。所有受试者均签署知情同意书。排除了高血压、糖尿病、心功能不全、妊娠及肿瘤病人。每例病人采取4 mL全血用于研究。

1.2淋巴细胞分离及活性检测

2 mL新鲜全血与2 mL PBS混合后缓慢加入竖立的4 mL淋巴细胞分离液表面。吸取淋巴细胞层，用缓冲平衡盐溶液洗涤并稀释淋巴细胞。取100 μL淋巴细胞悬液与等体积0.4%(质量分数)台盼蓝混合，取10 μL混合液滴入血细胞计数仪。死亡淋巴细胞呈蓝色，存活的淋巴细胞不染色。计算存活淋巴细胞比例。

1.3qRT-PCR检测

采用RNAprep Pure Blood Kit试剂盒(天根生化公司，北京)提取淋巴细胞总RNA。采用260/280nm吸光度比值检测RNA纯度。琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。采用First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒反转录cDNA(天根生化公司，北京)。PML、p53、bcl-2和β-actin的引物序列见表1。

PCR反应体系如下：94 ℃ 2 min，94 ℃ 40 s，61 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 10 min，共42个循环。所有结果都参照管家基因β-actin来调整mRNA浓度以控制mRNA浓度偏倚。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primers used for qRT-PCR

1.4流式细胞学荧光检测

用PE-CD3和FITC-PML双染全血淋巴细胞。PML、p53、bcl-2和bax抗体购于Santa Cruze 生物技术公司(美国)。流式细胞仪读取平均荧光强度。

1.5统计学方法

2 结果

2.1淋巴细胞活性和mRNA质量测试

提取的淋巴细胞浓度为(0.5～1.0×10)6/mL，存活淋巴细胞比例>90%。mRNA吸光度A260/A280比值为 2.00±0.15，mRNA纯度满足试验要求。mRNA琼脂糖凝胶电泳在28S和18S处有两条清晰条带，mRNA完整性满足实验要求。

2.2PML在银屑病病人外周血淋巴细胞中表达增加

银屑病病人中PML mRNA相对表达量(relative quantity, RQ)值为14.98±3.64，显著高于健康对照组5.50±1.10(t=16.79,P<0.05)。银屑病病人组的PML蛋白平均荧光强度为3.13±0.27，高于健康对照组PML蛋白平均荧光强度2.43±0.21(t=6.93,P<0.05)(图1)。

2.3p53、bcl-2和baxmRNA和蛋白在银屑病病人外周血淋巴细胞中的表达情况

与健康对照组相比，银屑病组中p53 mRNA表达增加，银屑病组和对照组的RQ值分别为1.14±0.42和0.82±0.30(t=2.219，P<0.05)；bcl-2和bax mRNA表达显著下降，前者在银屑病组和对照组的RQ值分别为0.54±0.30和0.88±0.20(t=-2.903，P<0.05)；后者在银屑病组和对照组的RQ值分别为0.42±0.36和0.87±0.30(t=-2.907，P<0.05)(图2)。

图1 PML在银屑病病人外周血淋巴细胞中表达增加Fig.1 Expression of PML increased in peripheral lymphocyte of psoriasis patients

A: RQ value of PML mRNA;B: mean fluorescence intensity of PML protein.*P<0.05vsnormal group.PML:promyelocytic leukaemia;RQ: relative quantity.

图2 两组外周血淋巴细胞中p53、bcl-2和bax mRNA表达情况Fig.2 mRNA levels of p53, bcl-2 and bax inperipheral lymphocyte of psoriasis patients andhealthy donors

*P<0.05vsnormal group;RQ:relative quantity;bcl-2: B-cell lymphoma-2;bax:bcl-2 associated X protein.

蛋白表达方面，p53在银屑病组和对照组的平均荧光强度分别为3.47±0.29和2.90±0.21(t=4.68，P<0.05)和bax在银屑病组和对照组的平均荧光强度分别为9.38±0.27 和8.32±0.43(t=7.00，P<0.05)。与健康对照组相比，两者在银屑病组的表达上调，而bcl-2表达下降，其在银屑病组和对照组的平均荧光强度分别为3.99±0.29 和4.75±0.31(t=-6.82，P<0.05)(图3)。

图3 两组外周血淋巴细胞中p53、bcl-2和bax 蛋白表达情况Fig.3 Protein levels of p53, bcl-2 and bax in peripheral lymphocyte of psoriasis patients and healthy donors

*P<0.05vsnormal group;bcl-2: B-cell lymphoma-2;bax:bcl-2 associated X protein.

2.4银屑病病人外周血淋巴细胞中PML蛋白表达水平与p53、bcl-2和bax蛋白表达水平相关

PML-p53、PML-bcl-2以及PML-bax的Pearson相关性系数分别为0.882、0.764和0.741(P<0.05)。银屑病病人外周血淋巴细胞中PML蛋白表达水平与p53、bcl-2和bax蛋白表达水平具有较强的正相关性。

3 讨论

银屑病中存在凋亡与过度增生平衡失衡。PML可直接或间接地作用于多种凋亡相关因子，从而在上述平衡中发挥重要作用。迄今为止，尚缺乏研究关注PML是否或如何参与调控银屑病发病过程。本研究结果提示PML蛋白在银屑病病人外周血淋巴细胞中表达升高，并与p53、bcl-2和bax蛋白的表达呈强相关性。

PML蛋白和PML-NBs已被证实参与多种细胞凋亡调控途径[6-7]。PML可通过死亡受体途径如F2、TNF-α、通过调节促凋亡转录因子如p53、调节转化生长因子TGF-β途径以及内质网相关的凋亡直接调控生长抑制信号。多数研究者[8-9]关注PML在细胞核内的作用，但部分研究[8]显示PML在胞质内亦可影响生长抑制和细胞凋亡。研究[9]显示当PML缺失或缺陷，或PML-NBs不能正常组合，细胞将呈现出异常增生，这提示PML在凋亡和异常增生平衡中或发挥内源性保护作用。一项食管鳞状细胞癌的研究[10]显示，PML蛋白表达下调与疾病进展及预后不良相关，研究者[10]认为PML可作为食管鳞状细胞癌的预后生物标志物。就银屑病而言，PML mRNA在银屑病皮损中表达上调[11]，但尚无研究关注PML在银屑病外周血淋巴细胞中的表达。本研究结果显示PML mRNA和蛋白水平在银屑病外周血淋巴细胞中表达升高，提示PML或在银屑病异常的炎性反应状态中发挥自我平衡作用。

p53在各种疾病的发生、发展过程中均具有重要作用。在银屑病领域，既往研究多关注于p53在角质形成细胞异常增生中的作用，而非外周血淋巴细胞。Yazici等[11]评估了p53在斑块型和点滴型银屑病皮损中的表达情况，发现p53表达升高与慢性斑块型银屑病呈强相关。本研究结果提示p53在银屑病病人外周血淋巴细胞中表达升高且与PML表达相关。研究[12]提示PML参与调控p53介导的信号途径，PML可通过与p53直接作用调控p53生物学功能，PML募集p53到PML-NBs以促进p53乙酰化和磷酸化、结合并抑制p53主要的负性调控因子Mdm2、通过疱疹病毒相关性泛素特异性蛋白酶(herpesvirus-associated ubiquitin specific protease, HAUSP促进p53去泛素化，多种途径活化p53[13]。研究[14-15]进一步发现，即使突变p53的功能活化亦依赖于PML蛋白。

Bcl-2家族是一类重要的凋亡调控因子，在维持细胞生长和凋亡平衡中具有重要作用。Bcl-2家族同时包括抗凋亡成员(如bcl-2)和促凋亡成员(如bax)。bcl-2和bax同时分布与胞质和核浆内。Bcl-2通过调控编码凋亡蛋白相关基因并干扰过氧化损伤，从而抑制凋亡。研究[7]显示bcl-2通过与NF-kappa B形成bcl-2-NF-kappa B复合物抑制NF-kappa B的DNA结合活性，从而阻断相关基因表达。PML可直接结合bcl-2，从而竞争性抑制bcl-2与NF-kappaB结合，从而促进凋亡。除了PML可与bcl-2结合之外，bax亦可与bcl-2结合形成异二聚体，从而抑制bcl-2的抗凋亡作用。并且bcl-2-bax结合与bcl-2-PML结合呈竞争性方式。在银屑病领域，研究[16-18]显示在角质形成细胞中，bcl-2蛋白表达显著下降；而与对照组相比，银屑病病人血清bcl-2浓度无显著变化， 但尚无研究关注bcl-2家族在银屑病外周血淋巴细胞中的表达情况。本研究结果显示，与在健康对照中的结果相比，bcl-2 mRNA和蛋白以及bax mRNA在银屑病病人外周血淋巴细胞中表达下降，而bax蛋白表达升高，且与PML呈相关性。因为蛋白是基因功能的主要执行者，因此更应关注与相关分子蛋白水平的表达。笔者认为bcl-2家族在银屑病病人外周血淋巴细胞中的表达变化可能是对银屑病异常炎性反应状态的一种保护性反应。

总之，与在健康对照组中的表达相比，PML、p53和bax蛋白在银屑病病人外周血淋巴细胞中表达升高，而bcl-2蛋白表达下降，这将导致淋巴细胞凋亡增加，可能是对银屑病异常炎性反应状态的一直保护性反应。本研究结果提示PML蛋白表达与p53、bcl-2和bax蛋白表达相关。PML可能在银屑病炎性反应中发挥自稳性作用。尚需要进一步的研究明确PML影响哪个亚型淋巴细胞以及其具体的机制。

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Overexpressionofpromyelocyticleukaemiagenecorrelatedwithp53andbcl-2familyinpsoriaticperipherallymphocytes

Peng Shiguang, Li Na, Lan Zulian, Li Li, He Yanling*

(DepartmentofDermatology,BeijingChaoyangHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100020,China)

ObjectiveTo investigate the expressions of promyelocytic leukaemia (PML) gene, p53, bcl-2 and bcl-2 associated X protein (bax) in psoriatic peripheral lymphocytes, and evaluate the relationships betweenPMLand those candidate proteins.MethodsTwenty-five psoriasis patients and 20 healthy donors were recruited. The peripheral lymphocytes were isolated. The mRNA and protein levels of PML, p53, bcl-2 and bax in peripheral lymphocytes were detected by qRT-PCR and flow cytometry, respectively. Pearson correlation matrix analysis was conducted to evaluate the relationships betweenPMLprotein and those candidate proteins.ResultsThe mRNA and protein ofPMLand p53 were increased, while protein of bcl-2 decreased in peripheral lymphocytes of psoriasis patients as compared to healthy blood donors. The mRNA of bax decreased while protein of bax increased in psoriatic peripheral lymphocytes. The expression of PML protein was correlated with p53, bcl-2 and bax proteins in psoriatic peripheral lymphocytes.ConclusionPML may play a role in the mechanism of psoriasis.

promyelocytic leukaemia (PML)；psoriasis; p53; Bcl-2 family; apoptosis

北京市自然科学基金项目(7102060)。This study was supported by Natural Science Foundation of Beijing(7102060).

*Corresponding author， E-mail：heyanling@medmail.com.cn

时间：2017-10-14 16∶19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20171014.1619.034.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.05.003]

R758.63

2017-05-09)

编辑 慕 萌