PA-MSHA对结肠癌细胞HT29迁移的抑制作用

陈 萌 李 琳 王一同 吴 淦 马雨萌

华北理工大学基础医学院 河北唐山 063000

PA-MSHA对结肠癌细胞HT29迁移的抑制作用

陈 萌 李 琳 王一同 吴 淦 马雨萌

华北理工大学基础医学院 河北唐山 063000

①目的 探讨铜绿假单胞菌-甘露糖敏感血凝素菌毛株菌苗(PA-MSHA)对结肠癌细胞HT29的迁移抑制作用，并分析其可能的作用机制。②方法 培养结肠癌细胞株HT29，以不同剂量的PA-MSHA作用于细胞，倒置显微镜观察细胞形态，Transwell小室检测不同剂量PA-MSHA对结肠癌细胞迁移作用的影响，应用Western Blot检测PA-MSHA作用前后基质蛋白MMP-2的表达情况。③结果 PA-MSHA作用后，光镜下观察细胞生长受阻；PA-MSHA处理组结肠癌细胞迁移数量均低于对照组，且随着药物浓度的升高，迁移细胞数量逐渐减少；高剂量及低剂量PA-MSHA处理组细胞MMP-2表达均低于对照组，且高剂量组低于低剂量组，差异均有统计学意义。④结论 PA-MSHA能够抑制结肠癌细胞HT29的迁移，作用机制可能与其下调MMP-2的表达有关。

PA-MSHA 结肠癌 迁移

结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，在全国范围内其死亡率仅次于肺癌和肝癌，位居第三，严重危害人类的健康[1]。近年来，结肠癌的发病率逐年递增，大约有一半的患者在确诊时已发生其他部位的转移[2]。而结肠癌的转移是其死亡的重要原因，如何有效抑制转移的发生是近年来肿瘤研究的热点领域[3]。研究发现，结肠癌细胞的转移不仅与肿瘤细胞的生长速度有关，还与基质金属蛋白酶MMP-2表达相关。MMP-2是肿瘤转移重要的促进的因子[4]。临床医疗实践中，通过手术对恶性实体肿瘤进行摘除,而对于散在的癌细胞多采用化疗和放疗手段。但化疗和放疗在作用于癌细胞的同时也对正常细胞产生毒性作用，带来了较大的副作用。而近年来，随着免疫技术的迅速发展，生物治疗已逐渐应用于肿瘤治疗[2]。通过微生物制剂抑制癌细胞发展来治疗肿瘤的方法日益受到重视[5]。铜绿假单胞菌-甘露糖敏感血凝素菌毛株菌苗(PA-MSHA)是一种新型的广谱免疫调节剂，它是用普通绿脓杆菌为载体表达甘露糖敏感性菌毛的灭活制剂，可以与肿瘤细胞表面的甘露糖特异性结合，发挥抗肿瘤作用，抑制肿瘤的作用明显且副作用小[6]。但目前研究对象多针对肝癌，对结肠癌研究较少[7]。为此本研究以不同剂量的PA-MSHA作用于体外培养结肠癌细胞株HT29，用倒置显微镜观察细胞形态的改变，采用Transwell小室检测不同剂量PA-MSHA对结肠癌细胞迁移作用的影响，应用Western Blot检测PA-MSHA作用前后基质蛋白MMP-2的表达情况。探讨PA-MSHA对结肠癌细胞HT29迁移的抑制作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1材料 结肠癌细胞株HT29 ，购自中科院肿瘤医院。铜绿假单胞菌注射液(Pseudomonas Aerugi-nosa InL/jection，1.6～2.0×10/mL，1.0mL支，批号：20160606)，RPMI-1640,Transwell板(corning)，胎牛血清,SDS-PAG试剂盒，Bradford蛋白浓度测定试剂盒，DMEM培养基(高糖) Hyclone均购自北京碧云天生物公司。二甲基亚砜购自Amresco公司。 Cyclin D1抗体、β-Actin 单克隆抗体购自Abbkine 公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 结肠癌细胞株HT29于DMEM培养基37℃、5%CO2条件下进行细胞培养，每3～4天更换培养基。用0.25%胰蛋白酶消化后1:3传代，取对数生长期的细胞进行实验。

1.2.2药物处理及实验分组 取对数生长期的HT29细胞，用不同剂量的PA-MSHA处理。共六组，分别为对照组及5个药物浓度组(10μmol/L、20μmol/L 、40μmol/L、80μmol/L及160μmol/L)。对照组加入同等剂量PBS。

1.2.3细胞形态学观察 应用倒置显微镜观察对照组及不同浓度实验组作用24小时后细胞的形态变化并拍摄记录结果。

1.2.4细胞迁移能力测定 制备细胞悬液，用无血清的DMEM培养基进行重悬，调整细胞密度1×10 个/mL。24孔板下室加入600μL含20%胎牛血清的培养基，上室加入100μL细胞悬液进行接种，下室分别用不同剂量的PA-MSHA处理。共六组，分别为对照组及5个药物浓度组(10μmol/L、20μmol/L 、40μmol/L、80μmol/L及160μmol/L)。37℃培养细胞24小时。用1%结晶紫染色10分钟，100倍显微镜下随机五个视野观察并计数迁移细胞。

1.2.5Western Blot检测MMP-2蛋白水平 分为对照组、低剂量组(10μmol/L)、高剂量组(160μmol/L)，细胞总蛋白提取、测定并调整各组总蛋白含量相等，进行SDS-PAGE电泳。封闭转移2小时后的PVDF膜用丽春红染液染5分钟。将PVDF膜置于杂交袋中，加入封闭液稀释的一抗，室温摇动反应1小时。PBS洗涤PVDF膜3次，每次15分钟。加入封闭液稀释的二抗，室温摇动反应30分钟。PBS洗涤PVDF膜4次，每次15分钟。然后进行ECL化学发光检测，将PVDF膜置于等量混合ECL的A液和B液中，室温孵育反应3～5分钟，暗室曝光显影。

2 结果

2.1PA-MSHA作用HT29细胞后形态学观察结果 倒置显微镜下(×100)可见结肠癌细胞在PA-MSHA不同剂量组中形态学上有明显变化。对照组细胞多呈梭形或多角形，排列紧密，生长状态良好，贴壁，明亮，增殖活跃。而PA-MSHA各处理组细胞数量较对照组明显减少，细胞小且圆，贴壁性减弱。在镜下可观察PA-MSHA浓度最高(160μmol/L)组几乎无呈梭形或多角形的细胞，大多为圆形，体积更小，细胞暗淡，胞固缩明显，结果见图1～6。

图1对照组(×100)

图2 PA-MSHA(10μmol/L)(×100)

图3 PA-MSHA(20μmol/L)(×100)

图4 PA-MSHA(40μmol/L)(×100)

图5 PA-MSHA(80μmol/L)(×100)

图6 PA-MSHA(160μmol/L)(×100)

2.2PA-MSHA作用HT29细胞后的迁移结果 PA-MSHA不同浓度组细胞迁移数量均低于对照组，且随着药物浓度的升高，迁移细胞数量逐渐减少；不同浓度组间迁移细胞数量差异具有统计学意义(F=35.69，P=0.02)。见表1及图7～12。

表1 不同组别Transwell迁移细胞测定结果比较

图7对照组(×100)

图8 PA-MSHA(10μmol/L)(×100)

图9 PA-MSHA(20μmol/L)(×100)

图10 PA-MSHA(40μmol/L)(×100)

图11 PA-MSHA(80μmol/L)(×100)

图12 PA-MSHA(160μmol/L)(×100)

2.3PA-MSHA作用HT29细胞后Western Blot检测MMP-2蛋白结果 160μmol/L及10μmol/L组细胞MMP-2表达均低于对照组，且高剂量组低于低剂量组，差异具有统计学意义(F=28.06，P=0.001)，结果见表2及图13。

表2 不同组别细胞MMP-2表达结果比较

图13 PA-MSHA作用HT29细胞Western Blot检测MMP-2蛋白

3 讨论

铜绿假单胞菌注射液为基因工程改造后的制剂,其与自然界铜绿假单胞菌的最显著不同是周身长有浓密的甘露糖敏感性血凝素菌毛[8]。因此该菌株也称为“铜绿假单胞菌-甘露糖敏感血凝素菌毛株菌苗”,简称为PA-MSHA[9]。其为广谱免疫调节制剂,具有特异性高、安全性好、不良反应低、调节和重建机体免疫功能等特点[10]。已有的研究表明，PA-MSHA可以调节患者的免疫反应和免疫平衡以及降低肿瘤患者的感染率，对于多种恶性肿瘤均具有抑制作用，可以作为恶性肿瘤治疗的辅助措施[5]。

周建炜等研究表明，PA-MSHA可以明显抑制肝癌细胞的生长状态[6]。而本研究采用倒置显微镜观察可见结肠癌细胞在PA-MSHA不同剂量组中形态学上有明显的变化。对照组细胞多呈梭形或多角形，排列紧密，生长状态良好，贴壁，细胞明亮，增殖活跃。而PA-MSHA各组细胞数量较对照组明显减少，细胞小且圆，贴壁性减弱。在镜下可观察PA-MSHA 160μmol/L组几乎无呈梭形或多角形的细胞，大多为圆形，体积更小，细胞暗淡，胞固缩明显。

PA-MSHA可以抑制肝癌细胞的转移能力[6]。在Transwell转移实验中对进入小室的细胞计数可反映肿瘤细胞的转移能力，结果显示PA-MSHA处理组细胞迁移数量均低于对照组，且随着PA-MSHA浓度的升高，迁移细胞数量逐渐减少，证实了PA-MSHA同样可以抑制结肠癌细胞的转移。

大量研究证明，MMP-2是一种重要的金属蛋白酶，是降解细胞外基质的主要酶类，与肿瘤的转移关系最为密切，多种实体瘤中均存在MMP-2的高表达[6]。此外，MMP-2可以激活MMP-9的表达，共同参与肿瘤转移的多个步骤[4]。MMP-2能够特异性的降解细胞外基质和基底膜，有利于血管内皮细胞的迁移，是反应结肠癌进展的生物学标志。而本实验Western Blot结果表明PA-MSHA作用结肠癌细胞后，MMP-2基因蛋白表达明显下降，基质降解能力降低，进而抑制了结肠癌细胞的转移能力。

本次实验不仅证实了PA-MSHA能够抑制结肠癌细胞HT29的迁移，并研究出其作用机制是PA-MSHA通过下调基质金属蛋白酶MMP-2的表达来抑制细胞转移，进而在结肠癌的治疗上得到进一步研究和应用。

综上所述，PA-MSHA在结肠癌的辅助治疗中具有重要价值，支持了PA-MSHA开展临床治疗癌症的可行性。当然在其他肿瘤方面，PA-MSHA的抑癌效果及作用机制需要更多的体外细胞株和体内动物实验来进行探究。

[1] 王 健. 整合素ανβ6内吞胞吐循环在调控结肠癌细胞迁移中的作用及分子机制研究[D].济南:山东大学,2012

[2] 林 涛,宋 纯,王 辉.晚期结直肠癌术中使用铜绿假单胞杆菌制剂的生存期观察[J].中国肺癌杂志,2009,12(6):639-641

[3] 汤庆超,陈瑛罡,王贵玉,等. 结直肠癌术中腹腔内应用铜绿假单胞菌注射液疗效观察[J].中华结直肠疾病电子杂志,2014,3(1):27-30

[4] 崔若凡,张宝刚,姬 静,等.ARK5、MMP-2和MMP-9在胃癌中的表达及与侵袭转移的关系[J].实用医学杂志,2012,28(7):1073-1076

[5] 尹铁球,欧阳旋,焦芳艳,等.铜绿假单胞菌制剂经由甘露糖依赖方式影响人宫颈癌Hela细胞株的生长研究[J].实用预防医学,2013,20(9):1040-1044

[6] 周建炜,李涛,任正刚,等.绿脓杆菌制剂对人肝癌MHCC97L细胞增殖和侵蚀能力的影响[J].中华肝胆外科杂志,2010,6(16):455-459

[7] 孙 杰,马 钢,李俊彦,等.铜绿假单胞菌制剂对大鼠C6胶质瘤细胞作用的实验研究[J].昆明医学院学报,2010,31(10):21-26

[8] 王 浩,唐利立.铜绿假单胞菌注射液对人乳腺癌细胞的体外杀伤及促凋亡作用研究[J].中南药学,2010,8(4):307-310

[9] 王 浩.铜绿假单胞菌注射液(PA-MSHA)对乳腺癌治疗作用及其机制研究[D].长沙:中南大学,2010

(2017-03-27 收稿)(张爱国 编辑)

TheinhibitioneffectofPA-MSHAonthemigrationofcolontumorcellHT29

CHEN Meng,LI Lin,WANG Yitong,et al

(School of Basic Medical Sciences,North China University of Science and Technology,Tangshan 063000,China)

ObjectiveTo explore the inhibition effect of PA-MSHA on the migration of colon tumorcell HT29 and analysis its possible mechanism.MethodsHT29 cells were cultured and treated with different doses of PA-MSHA.The morphology of HT29 cells was observed by inverted microscope,and transwell assay was performed to detect the migration of HT29 cells treated with PA-MSHA,Western blot was used to analyze the expression of matrixmetalloprotein-2(MMP-2) proteins.ResultsThe migration of HT29 cells were suffocated under the light microscope after treated with PA-MSHA,the transference number of the cells in the treatment group was less than that in control group.As the result,the number of transference cells gradually decreased with the increasing of PA-MSHA,the expressions of MMP-2 in cells from high dose and low dose treatment group were less than those in the control group,and expressions of MMP-2 in cells from high dose was less than that from low dose group.The differences were significantly(P<0.05).ConclusionPA-MSHA can inhibit the transference of HT29 cells,and its mechanism is related to the down regulation of MMP-2.

PA-MSHA.Colon Cancer.Migration

R 730.5

A

2095-2694(2017)05-343-04

国家级大学生创新项目(编号：X2016032)。

陈 萌(1996-)，女，本科生。研究方向：肿瘤诊断。

李 琳。