A型肉毒毒素对人瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡影响的实验研究

杨艳清++张洁++许其军++吴希晞++黄燕++高扬++江昌艳

[摘要]目的：探讨A型肉毒毒素对人瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡的影响。方法：体外分离和培养人瘢痕疙瘩成纤维细胞，实验组在细胞培养过程中加入A型肉毒毒素（稀释成5U/0.1ml）进行干扰，空白对照组培养液中不加A型肉毒毒素。培养72h后利用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果：3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐[3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide， MTT]法显示A型肉毒毒素作用后细胞增殖速度变慢；流式细胞仪检测显示实验组早期凋亡和晚期凋亡的细胞数量较空白对照组均明显增多，成纤维细胞凋亡率差异有统计学意义（P<0.05）。结论：A型肉毒毒素可以抑制瘢痕疙瘩组织中成纤维细胞的增殖活性，诱导成纤维细胞的凋亡。

[关键词]A型肉毒毒素；瘢痕疙瘩；成纤维细胞；细胞增殖；凋亡

[中图分类号]R619+.6 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2017）09-0043-03

Effects of Botulinum Toxin Type A on Apoptosis of Human Keloid Fibroblast

YANG Yan-qing，ZHANG Jie，XU Qi-jun，WU Xi-xi，HUANG Yan，GAO Yang， JIANG Chang-yan

（Department of Plastic Surgery， Tongren Hospital of Wuhan University，Wuhan Third Hospital，Wuhan 430060，Hubei，China）

Abstract： Objective To investigate the effects of botulinum toxin type A （BTXA） on apoptosis of human keloid fibroblast. Methods Human keloid fibroblast was isolated and cultured in vitro， the medium containing BTXA（diluted concentration of 5U/0.1ml）was used to intervene the cell growth in experience group， BTXA was not added in blank control group. At 72 hours after cells were cultured， cells apoptosis were measured by flow cytometry（ FCM ）. Results Cells proliferation rate was slow with MTT method. The cell numbers of early and late apoptosis in experience group were significantly more than those of early and late apoptosis in blank control group with FCM， showing a significant difference between them（P<0.05）. Conclusion BTXA can inhibit the proliferation and induce apoptosis of human keloid fibroblast.

Key words： botulinum toxin type A； keloid； fibroblast； cell proliferation； apoptosis

瘢痕疙瘩屬于整形外科难治性疾病之一，对于较局限性的瘢痕疙瘩，瘢痕内药物注射是主要的治疗方法，目前最常用的药物是激素类药物，但是注射后，可能发生不易被患者接受的不良反应[1-2]。近年来，有研究表明A型肉毒毒素可治疗和预防瘢痕疙瘩[3-6]，但作用机制还不是十分清楚[7-8]。笔者在体外培养人瘢痕疙瘩成纤维细胞的基础上，研究了A型肉毒毒素对成纤维细胞凋亡的影响，以进一步探索其治疗瘢痕疙瘩的作用机制。

1 临床资料

收集2015年6月-2016年12月在笔者科室行上臂瘢痕疙瘩切除的患者组织标本29例，均为男性，年龄18～36岁，平均28.16岁。取材前6个月没有药物治疗史，标本的获取征得患者本人同意。使用材料：A型肉毒毒素（衡力；兰州生物制品研究所）。

2 方法

2.1 人瘢痕疙瘩成纤维细胞的分离和培养：手术台获取29例患者上臂瘢痕疙瘩组织标本，磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline，PBS）反复浸泡冲洗，加入1ml 0.25%胰酶，4℃过夜。次日分离表皮和真皮，将组织块剪碎成小放入离心管中，加入组织量2倍的0.2%IV型胶原酶，37℃消化。向离心管中加入2ml PBS，吹打组织块，过200目筛网，制备单细胞悬液，细胞悬液离心后弃上清，加入4ml含双抗的10%胎牛血清重悬细胞。细胞计数并以2×106/ml细胞量接种于培养瓶中，置于恒温细胞培养箱中25min，PBS反复冲洗2次，尽量去除未贴壁细胞，以纯化细胞。更换含双抗的10%胎牛血清4ml，置于恒温细胞培养箱中培养，次日换液，以后每2～3d换液一次。

2.2 MTT法绘制细胞生长曲线：收集第4代成纤维细胞，分为实验组和空白对照组。实验组加入含A型肉毒毒素5U/0.1ml（临床常规浓度范围）的1%胎牛血清DMEM，空白对照组培养液中不加A型肉毒毒素。以1×104/孔的浓度接种细胞于96孔板，96孔板每一行设5个复孔，同时设空白组1孔（仅加入培养基）以作为细胞孔的调零对照。每天在相同的时间点取孔板的一行进行检测，连续8d。以时间为横坐标，OD值为纵坐标，绘制出两组细胞的生长曲线。

2.3 观察肉毒毒素对瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡的影响：收集第4代成纤维细胞，分成6组，实验组和空白对照組各3组。实验组加入含A型肉毒毒素5U/0.1ml的1%胎牛血清DMEM，空白对照组培养液中不加A型肉毒毒素。72h后流式细胞仪检测，观察细胞凋亡情况：六孔板中的细胞用PBS洗涤一次，加入1ml 0.25%胰酶消化细胞，待细胞变圆且有部分细胞悬浮时加入PBS终止消化。用移液枪轻轻吹打细胞，使细胞悬浮。收集于流式管中，离心、弃上清。加入3ml 4℃预冷的PBS完全重悬细胞，1 500r/min离心5min，弃上清，沉淀用300μl的Binding Buffer重悬。加入5μl Annexin V-FITC混匀后，再加入5μl Propidium Iodide混匀。室温下避光反应5min。于1h内进行流式细胞仪检测。

2.4 统计学分析：采用SPSS13.0软件进行统计分析，两组间的细胞光密度值比较采用两样本t检验，两组间细胞凋亡率比较采用χ2检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 A型肉毒毒素对成纤维细胞增殖能力的影响：成纤维细胞的生长曲线均呈上升“S”形，有明显的潜伏期、指数增殖期和平台期，符合细胞生物学的生长规律。空白对照组第3天开始进入对数增长期，实验组第5天开始进入对数增长期（图1）。从指数增殖期开始，相同时间点测得两组细胞的光密度值（OD值），差异均具有统计学意义（P<0.05）。

3.2 A型肉毒毒素对成纤维细胞凋亡的影响：从流式散点图可知，加入A型肉毒毒素作用于成纤维细胞后，实验组出现早期凋亡和晚期凋亡的细胞较空白对照组均明显增多（图2）。通过χ2检验发现，实验组与空白对照组样本比较，成纤维细胞凋亡率差异有统计学意义（P<0.05）（表1）。

4 讨论

瘢痕疙瘩是良性皮肤纤维组织的增生性病变，其中成纤维细胞的过度增殖是瘢痕疙瘩的主要病理组织学特征之一[9]。成纤维细胞凋亡在创伤后组织修复过程中具有重要影响，细胞凋亡与瘢痕疙瘩的形成也有密切关系[10-11]。A型肉毒毒素作为有效预防和治疗瘢痕疙瘩的可能方法，其对瘢痕疙瘩组织中成纤维细胞的增殖和凋亡的影响还有待于深入研究，这有助于进一步阐明肉毒毒素治疗瘢痕疙瘩的作用机制。

为了观察A型肉毒毒素对成纤维细胞的影响，笔者通过获取人瘢痕疙瘩组织标本，在体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞，然后加入A型肉毒毒素作用于成纤维细胞。应用MTT法绘制成纤维细胞的生长曲线可以发现，实验组细胞指数增殖期延迟，而且进入平台期细胞的OD值显著低于空白对照组的细胞OD值，差异具有显著统计学意义，这说明A型肉毒毒素对成纤维细胞的增殖有一定的抑制作用，这可能是肉毒毒素对瘢痕疙瘩发挥治疗作用的原因之一。进一步运用流式细胞学技术检测细胞凋亡情况，结果显示，A型肉毒毒素作用后，成纤维细胞的早期和晚期凋亡率较空白对照组明显增加，差异具有统计学意义，这表明A型肉毒毒素可以一定程度地诱导成纤维细胞的凋亡，也提示其对瘢痕疙瘩的治疗作用可能是通过促使成纤维细胞凋亡，减少胶原分泌来实现的。

本研究表明，A型肉毒毒素既可以抑制成纤维细胞的增殖，又能促进其凋亡，进而达到治疗瘢痕疙瘩的目的。但是在临床治疗中，有关A型肉毒毒素使用的浓度和剂量，没有统一的标准[12-13]。本研究中参考国内临床使用A型肉毒毒素常用的剂量方案[14-15]，按照50U/1ml的浓度来配置，经体外实验研究得出了上述结论。为了达到更优化的治疗效果，还需要在临床工作中探索出比较合理的A型肉毒毒素药物配置的浓度和注射剂量。

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[收稿日期]2017-03-10 [修回日期]2017-07-21

编辑/张惠娟