5′核酸外切酶特异性荧光探针的设计和应用

方思敏， 李梦圆， 赵美萍

(北京分子科学国家实验室，北京大学化学与分子工程学院，北京 100871)

5′核酸外切酶是一类重要的核酸损伤修复酶，具有5′～3′方向的外切活性，参与DNA的复制、重组和修复过程，对于维持基因组的稳定性具有非常重要的作用[1 - 5]。人类核酸外切酶1(hEXO1)是人体中主要的5′外切酶，它参与碱基错配修复(MMR)、双键断裂修复(DSBR)等多种DNA损伤修复途径[6]，同时对于转录诱导的端粒结构重组中端粒的维持具有重要意义[7]。hEXO1的活性缺陷可导致碱基错配修复不及时，会对人体健康造成严重的危害，如导致自发性变异[8 - 10]、遗传性非息肉性结肠直肠癌[11 - 12]以及15%～25%散发性肿瘤的发展[13]；而双键断裂修复不及时则会导致染色体重排或消失、癌症或过早老化[14]。5′外切酶活性的异常与疾病密切相关，因此，开发其特异性荧光探针，用于生物样品中该酶活性的一步快速检测具有重要的生物学研究和临床诊断的意义。

目前关于5′核酸外切酶参与DNA损伤修复的机理方面已开展了大量研究[1 - 7]，但关于生物样品中5′外切酶活性及含量定量检测方法的报道非常缺乏。DNA荧光探针法由于具有灵敏度高、成本低、设计灵活、操作简单和响应迅速等优点，被广泛应用于核酸酶的分析检测和成像[15 - 16]。本工作以与hEXO1具有序列同源性、酶切性质相近且易获得的T5外切酶作为模型酶[17]，根据其与DNA底物反应的特性设计了对5′外切酶具有高选择性、高灵敏度的DNA荧光探针。该探针具有3′突出末端，5′末端磷酸化修饰以及连续三对错配碱基的双链内环状发夹结构，能有效抑制其它核酸外切酶和内切酶的非特异性水解作用，避免其干扰检测。此外，研究中发现辅助蛋白和非离子表面活性剂的存在能够明显提高探针对目标酶的响应。该探针成功用于人血清样品中5′外切酶的一步快速测定，这是首例报道的可用于人血清中5′外切酶一步快速定量检测的荧光探针方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Nano Drop 2000c 分光光度计(美国，Thermo)；Rotor-Gene Q 实时荧光PCR仪(德国，QIAGEN)；E -Centrifuge离心机(德国，Wealtec)；MLS-3020高压灭菌器(日本，Sanyo)；涡旋混合器(海门市其林贝尔仪器(中国)制造有限公司)。

T5外切酶(T5 Exo)、脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DNase Ⅰ)、外切酶Ⅰ(Exo Ⅰ)、外切酶Ⅲ(Exo Ⅲ)及其对应缓冲溶液(表1)，均购自美国NEB；TE缓冲溶液(10 mmol/L Tri-HCl,1 mmol/L EDTA,pH=8.0)；人血清白蛋白(HSA,≥96%)、牛血清白蛋白(BSA,≥98%)，均购自美国Sigma-Aldrich；链霉亲和素(>17 U/mg,1 U 结合1 μg D -生物素，pH=8.9)购自中国生工；Triton X-100购自中国西陇化工。

表1 各种核酸酶对应的最适缓冲溶液组成及pH值

本文中使用的寡核苷酸探针由上海生工生物工程有限公司合成，经过高效液相色谱(HPLC)纯化。各探针序列如表2所示。

表2 寡核苷酸探针序列

abold represents mismatched bases;the stem part of the hairpin probe is underlined;FAM is 6-carboxy-fluorescein and Texas red is 7-amino-4-methylcoumarin;BHQ1 and BHQ2 are Black Hole Quenchers 1 and 2;*represents phosphorothioated nucleotides.

1.2 探针结构优化

酶切反应均在200 μL封闭PCR管中进行，反应体系的总体积为50 μL，探针终浓度为100 nmol/L 或200 nmol/L。荧光强度的检测由Rotor-Gene Q完成，程序设置为在37 ℃每5圈测定一次荧光强度，共循环250圈，增益值设为10。荧光基团FAM的激发和发射波长分别为470 nm和510 nm，荧光基团Texas Red的激发和发射波长分别为595 nm和620 nm。根据荧光曲线初始上升阶段直线部分的斜率计算荧光上升的速率。

1.3 探针的线性范围和选择性

将T5酶的标准品(0.25～12.5 U/mL)与100 mg/mL BSA以及0.5%Triton X-100预混。然后取1.0 μL酶标样加入含有200 nmol/L探针P-6的缓冲溶液(67 mmol/L Glycine -KOH、6.7 mmol/L MgCl2、10 mmol/L 2-Mercaptoethanol)中，终体积为50 μL，实时监测荧光强度随时间的变化。由荧光强度随时间变化的直线部分线性拟合得出荧光上升的速率再与酶浓度作图，得到检测的线性范围。

将200 nmol/L探针P-6分别与T5、DNase Ⅰ、Exo Ⅲ、Exo Ⅰ 在其对应的缓冲溶液(表1)中反应，实时监测荧光上升信号。T5、DNase Ⅰ、Exo Ⅲ、Exo Ⅰ的终浓度分别为2.0 U/mL、10 U/mL、10 U/mL、10 U/mL。

1.4 新鲜人血清中5′外切酶含量的测定

取4.0 μL人血清样品，加入含200 nmol/L探针P-6的反应缓冲溶液(67 mmol/L Glycine -KOH、6.7 mmol/L MgCl2、10 mmol/L 2-Mercaptoethanol、2.0 mg/mL BSA和0.01% Triton X-100)中，反应体系的终体积和荧光测定方法同上。加标回收实验中T5酶标准品的浓度为0.01 U/mL。

2 结果与讨论

2.1 探针结构优化

图1 DNA双链末端结构对T5外切酶切割速率的影响。P-3、P-4和P-5的3′末端突出碱基个数分别为5、10、20；探针浓度：100 nmol/L；T5外切酶浓度：10 U/mL。F表示荧光基团，Q表示猝灭基团Fig.1 Effects of different terminal structures(P-1 and P-2) and overhang bases(P-3,P-4 and P-5) on the cleavage rate of T5 exoThe probe concentration is 100 nmol/L and the concentration of T5 Exo is 10 U/mL.F and Q represent FAM and BHQ1,respectively.

5′核酸外切酶可沿5′至3′方向移除位于线性或环状双链DNA的5′末端、切口或缺口处的核苷酸[18]。以T5外切酶作为5′核酸外切酶的模型酶，我们首先研究了不同双链DNA末端结构对酶切速率的影响。如图1和表2所示，当双链DNA中标有荧光基团和猝灭基团的单链5′末端为平末端(P-1)或突出末端(P-2)时，T5核酸外切酶对探针的切割速率非常慢。而当标记单链为5′凹末端时，酶切反应的速率明显加快(P-3、P-4 和P-5)。推测这一现象是由于互补链的3′突出结构更有利于T5外切酶与双链底物稳定地结合，从而使酶对标记单链的切割能更快速地发生[19 - 20]。我们进一步比较了互补链3′末端突出的碱基个数对酶切速率的影响。实验结果表明，3′末端突出碱基的个数改变时(从5个增加到15个)，酶对探针的切割速率变化不大。考虑到实际生物样品中除了目标酶外，还可能同时存在其他3′外切酶。根据已有的研究报道，当双链DNA的3′末端突出4个以上碱基时，可以不受双链3′外切酶(如Exo Ⅲ)的影响。而3′单链外切酶(如Exo Ⅰ)则需要与3′末端至少6个碱基结合才能对底物有效切割[21]。综合以上实验结果和非目标外切酶的特性，5′外切酶适合的DNA探针底物3′末端的突出碱基个数为5。

除上述核酸外切酶外，在生物样品如血液和细胞环境中，还可能同时存在含种核酸内切酶，如非限制性核酸内切酶(DNase Ⅰ)、各种限制性核酸内切酶和脱碱基核酸内切酶(Ape1)等。未经保护的核酸荧光探针极易受到核酸内切酶，尤其是DNaseⅠ的攻击，发生水解和产生假阳性信号[22 - 23]。虽然通过对磷酸骨架的硫酰化可以阻止这些内切酶的切割作用，但若在靠近5'末端的区域对磷酸骨架进行修饰，也会同时抑制目标酶对探针的水解作用。在我们之前报道的Ape1 检测方法中发现，当在天然的DNA双链结构内部引入两个连续的错配碱基对时，可有效减慢DNaseⅠ的水解作用，而继续增加一对含空位的错配碱基对可使探针被DNaseⅠ水解的速率进一步减小到只有上述连续两错配结构的10%左右[16]，这一结果表明第三对错配碱基对的引入对提高探针的选择性具有至关重要的作用。为使5′外切酶探针不受各种核酸内切酶的非特异性水解的影响，应在探针的双链区域设计至少连续3个错配碱基对形成的内环结构。

图2 5′核酸外切酶的特异性荧光探针P-6的结构和检测原理示意图Fig.2 Schematic representation of P-6 for measurement of the activity of 5′ exonuclease

综上，如图2所示，我们将5′外切酶的探针结构设计为具有3′突出末端的发夹式结构，并对5′末端进行磷酸化修饰，以利于5′外切酶识别并结合底物[24]。3′突出末端的突出碱基个数为5，探针茎部靠近5′末端第7～9个碱基的位置设计了连续三错配碱基形成的内环结构，而在内环的另一侧，对茎部骨架均进行了硫代保护。为了使酶切底物后迅速产生荧光信号，我们将荧光基团标记在5′末端第1个核苷酸的碱基上，而猝灭基团BHQ2标记在距5′末端的第10位碱基上，既能有效猝灭荧光又能避免产生空间位阻影响5′外切酶的酶切反应。当体系中无目标酶存在时，由于荧光基团与猝灭基因之间的荧光共振能量转移作用，荧光被猝灭；当体系中加入目标酶时，位于5′末端的第一个核苷酸迅速被切除，碱基上标记的荧光基团被释放到自由溶液中，荧光信号快速上升。

2.2 反应缓冲溶液组成的优化

在我们之前的研究工作中发现，在酶与DNA荧光探针的反应液中加入HSA对加快反应速率和提高检测的回收率有显著的作用[16]。利用上述设计合成的探针(P-6)我们研究了在反应液中加入HSA对T5酶切反应的影响。随着反应溶液中HSA浓度的增加，酶切反应速率逐渐增大，但荧光上升速率与酶浓度之间的线性关系并不理想。我们进一步尝试了在反应液中加入BSA或非离子表面活性剂Triton X-100，考察对反应速率的影响，同样也观察到了加速现象，且当将高浓度蛋白或表面活性剂先与T5外切酶预混，再加入含有探针的反应液中时，荧光上升速率更快。在两种反应条件下，方法的最佳线性范围均为0.1～1.0 U/mL，灵敏度为0.1 U/mL。在此基础上，我们先将BSA和Triton X-100混合，然后再与目标酶预混，之后再加入到含有探针的反应液中，实验发现，探针对目标酶的响应灵敏度进一步显著提高，表明BSA和Triton X-100对酶切反应的加快机理可能不同，并且二者之间可能还存在协同作用，其确切的作用机理目前还需进一步研究。经过详细优化，当BSA和Triton X-100在反应液中的终浓度分别为2.0 mg/mL和0.01%时，方法的灵敏度最高，对目标酶的检测限可达到0.005 U/mL，线性范围为0.005～0.1 U/mL，见图3。

图3 (A)不同T5外切酶浓度下探针P-6被水解过程的荧光强度随时间的变化；(B) 探针P-6的标准工作曲线，线性范围：0.005～0.1 U/mL,R2=0.998(内插图为在T5外切酶低浓度范围的荧光曲线图)Fig.3 (A)Time courses of the hydrolytic reaction of P-6(200 nmol/L) by T5 at different concentrations;(B) Linear working range of the assay: 0.005 to 0.1 U/mL,R2=0.998(Inset:shows the fluorescence curves obtained at low concentration levels of T5 Exo,from 0.005 to 0.025 U/mL)

在上述反应条件下，测定了探针P-6对其它可能共存酶(DNaseⅠ、Exo Ⅲ、Exo Ⅰ)的响应，并与其在各自最佳缓冲溶液(表1)中的反应速率进行了对比。结果表明，探针P-6与各干扰酶在上述T5的最佳缓冲溶液中的反应速率均不及在各自最佳缓冲溶液中测到的结果。图4(A)对比了各种干扰酶在自身的最佳缓冲液中对P-6的切割速率与目标酶在上述最优反应液中与P-6反应的荧光上升速率。可见，即使干扰酶的浓度高达目标酶浓度的40倍，P-6探针对其的荧光响应速率也远小于对目标酶，表明所设计的P-6探针结构对目标酶有良好的选择性。

2.3 人血清样品中5′外切酶含量的测定

基于以上研究结果，我们将探针P-6用于测定人血清样品中5′外切酶的活性，并利用T5外切酶进行了加入回收实验。共分析两份人血清样品，测得原血清中5′外切酶的含量为0.09±0.01 U/mL，加标回收率为100%±5% (n=3)。为了进一步排除血清样品中可能存在的其他酶的干扰，确保荧光信号确实是由5′外切酶切割探针P-6产生的，我们设计合成了对照探针P-6-C。该对照探针与P-6序列相同，不同之处是在探针的5′末端标记了生物素，并对该末端的两个磷酸二酯键进行了硫代修饰。这样得到的探针5′末端能完全抑制目标酶的作用，而由于其他结构与P-6完全一致，因此可以用来检验血清样品中是否含有其他活性物质能破坏P-6的结构从而产生假阳性信号。结果表明，在上述优化好的反应条件下，只有当T5浓度高于0.25 U/mL时，对照探针P-6-C才有微弱的荧光上升信号，其切割速率仅为相同浓度T5对P-6切割速率的约20%。而其它几种酶即使浓度高达10 U/mL，仍不会产生明显的荧光信号。将P-6和P-6-C用于对同样的血清样品进行测定，如图4(B)所示，P-6的荧光信号快速上升，而对照探针P-6-C基本没有产生荧光上升信号。这一结果有力地证实了探针P-6可用于特异性地定量检测血清中存在的5′外切酶。

图4 (A) 探针P-6的选择性。T5：2.0 U/mL;DNaseⅠ: 10 U/mL;Exo Ⅲ: 10 U/mL;Exo Ⅰ: 10 U/mL;(B) 工作探针P-6和对照探针P-6-C对血清样品响应的荧光强度随时间的变化Fig.4 (A)Selectivity of P-6(200 nmol/L) to T5(2.0 U/mL) over other nucleases(DNaseⅠ: 10 U/mL;Exo Ⅲ 10 U/mL;Exo Ⅰ 10 U/mL);(B) Time courses of the hydrolytic reaction of P-6(200 nmol/L) and P-6-C(200 nmol/L) by serum samples

3 结论

本文设计合成了对5′外切酶具有高选择性、高灵敏度的DNA荧光探针P-6。该探针为3′末端突出5个碱基，5′末端磷酸化修饰的发夹结构，荧光基团和猝灭基团分别标记在距5′末端的第1位和第10位碱基上，并且在双链部分距5′末端第7-9位碱基处引入了由连续3对错配碱基形成的内环结构。实验结果证实了上述设计可有效避免探针被3′外切酶及各种内切酶破坏，对5′外切酶具有高选择性。研究还发现，在外加蛋白BSA与非离子表面活性剂Triton X-100的辅助下，探针P-6对5′外切酶具有很高的灵敏度，线性范围为0.005～0.1 U/mL，检测限为0.005 U/mL。利用该探针，我们成功实现了人血清样品中5′外切酶的一步快速测定，测得血清中5′外切酶的含量为0.09±0.01 U/mL，回收率为100%±5%(n=3)。本文的研究结果不仅为实时监测生物样品中5′核酸外切酶的含量变化提供了简便有效的方法，也为临床疾病诊断、酶抑制剂的高通量筛选和更多功能相关的DNA修复蛋白的鉴定提供了非常有用的工具。