动物重大疾病的光电学传感技术新进展

邵 康， 聂阿秀， 韩鹤友

(农业微生物国家重点实验室，华中农业大学理学院，湖北武汉 430070)

1 引言

经济快速增长和人类诉求增加促进了畜牧业的集约化和规模化发展。然而，随之引发的动物疫病爆发以及疾病种类逐年增加，严重危害人类健康。据世卫组织(WHO)报道，至少有140种以上的动物疫病(占动物疾病总量的70%)可以直接由动物传染给人类。因此，开展动物重大疫病的检测工作对控制疾病爆发与蔓延具有重大意义。传统动物疫病检测方法主要包括乳胶凝集法(LAT)[1]、原位杂交[2 - 5]、病毒中和试验[6]、聚合酶链反应(PCR)[7 - 8]、酶联免疫吸附测定法(ELISA)[9 - 13]、 DNA芯片检测技术[14]等。1986年，乳胶凝集法首次应用于实际，并被批准用于检测猪伪狂犬病毒(PrV)特异性抗体[15]。例如，张慧敏等[1]利用静电作用，将带有磺酸基的三元聚合物乳胶微球与猪圆环病毒2型(PCV2)单克隆抗体结合，随后特异性结合病毒，使乳胶微球凝集实现对PCV2的检测。2002年，Seuberlich等[16]首次开发出串联的ELISA检测技术，用于同时检测PRRSV欧洲型和美洲型两种抗体，成为日常诊断、流行病调查以及疾病爆发调查的有力工具。Chang等[17]利用实时聚合酶链反应(RT-PCR)，实现了对PCV2的快速诊断和定量检测，并能快速区分PCV2和PCV1。该方法在一定程度上推动了PCV2相关疾病的致病机理的研究，是一种简单、可靠、价格低廉的检测方法。

然而，传统的检测方法往往具有耗时、灵敏度低、假阳性高以及易受干扰等缺点，难以用于大范围快速准确地检测动物病毒。因此，改进传统的检测方法以及发展新型的高灵敏检测技术对早期检测动物病毒、减小经济损失以及提高人类健康水平都具有极其重要的意义。光电学传感技术依托于光学和电学分析法，具有灵敏度高、检测范围宽、快速等优点，已成功用于动物重大疾病的检测。本文主要介绍比色[18 - 20]、荧光(FL)[21 - 24]、化学发光免疫(CLIA)[25]、电化学[26 - 28]、电化学发光(ECL)[29 - 31]以及表面增强拉曼散射(SERS)[32 - 34]传感技术在动物疾病检测中的应用。

2 动物疾病的光学传感技术

2.1 比色传感技术

ELISA方法是以抗体与抗原特异性识别作用为基础，利用酶促反应的显色现象和放大作用来达到检测目的的一种比色传感技术。1971年，ELISA方法首次被开发并应用于免疫球蛋白的测定[18]。之后，ELISA成为实验室和临床疾病诊断的黄金方法。然而，传统的ELISA方法存在着稳定性差、检测限高、检测范围窄等缺点，还需要进一步改善。针对上述问题，吴龙等[19]对传统的ELISA方法进行了改进，用SiO2纳米微球负载辣根过氧化物酶进行信号放大，发展了一种高灵敏的免疫传感器，并将其用于PCV2抗体的检测。该方法表现出极高的检测灵敏度，检测限可达0.05 ng/mL。此外，该信号放大的ELISA策略具有检测速度快、稳定性好、重现性好等优点，在临床诊断中有潜在的应用价值。

酶作为一种生物催化剂具有高度的专一性、高效性、多样性等优点。然而，酶的催化活性很容易受到温度、pH等外界条件的影响，容易失活，这在很大程度上限制了它的进一步应用。吴龙等[20]以Au-Pt/SiO2纳米微球(APS NCs)替代传统的酶，并利用磁珠的捕获和富集作用，发展了一种快速高效的无酶标记免疫吸附方法(EFISA)，高灵敏检测PCV2(图1)。实验表明，APS NCs稳定性好，克服了传统酶的缺点，且有极好的类酶活性，为无酶免疫传感提供了新的思路。

图1 非酶免疫吸附测定系统用于PCV2抗体的检测[20]Fig.1 Schematic of the enzyme-free immunosorbent assay system for the detection of PCV2 antibody[20]

2.2 荧光传感

另一方面，信号放大是提高荧光传感技术检测灵敏度的重要手段。在传统免疫荧光分析中，常常需要通过酶与底物反应，产生信号放大[36 - 38]。随着分析技术的发展，利用金属离子对荧光试剂的信号增强或减弱原理设计的一种新的信号放大策略受到了科研工作者的广泛关注[39 - 41]。李学普等[23]基于这种信号放大策略，设计出一种基于Ag+和CdSe QDs阳离子置换反应的荧光检测方法。利用释放的Cd2+增强罗丹明5N的荧光这一特性，实现了PrV抗体的超灵敏检测(图2)。与传统方法相比，该方法检测限更低、线性范围更宽，在动物疾病的检测方面具有潜在的应用价值。

图2 CdSe QDs阳离子置换反应的信号放大法检测猪伪狂犬病毒抗体[23]Fig.2 The method for detecting PrV antibody based on CdSe QDs with the cation exchange[23]

此外，基于荧光能量共振转移原理，利用一些纳米材料，如氧化石墨烯[42]、碳纳米管[43]、Au纳米粒子[44]、Fe3O4纳米粒子[45]等作为荧光猝灭剂，可以开发出各种各样的荧光传感策略。陈璐等[24]首次将生物相容性好、不易于聚集、导电性好的PtNTs[46]用作QDs的荧光猝灭剂，并基于荧光能量共振转移原理设计了一种用于检测猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)的荧光探针。与常规的QDs荧光分析法相比，该工作选取毒性比CdSe、CdTe QDs小的CdTe∶Zn QDs为荧光团[47]，扩宽了其在生物领域的应用。虽然利用纳米材料作为猝灭剂的荧光分析法已经普遍存在，但仍需发展新的纳米猝灭剂来实现精准检测。

2.3 化学发光免疫传感

化学发光免疫分析(CLIA)应用广泛，价格低廉、相比于传统的ELISA和荧光分析法，避免了光源不稳定的干扰，灵敏度和精确度均大大提高。张慧敏等[25]发展了一种在碱性条件下，NaCl-HCl-Br2氧化鲁米诺，AuCl-4加速鲁米诺电子转移增强化学发光用于超灵敏检测猪血清样品中的PCV2的免疫分析新方法，检测限可达2.67×102copy/mL(图3)。化学发光免疫分析法发展迅速，但现有的化学发光体系有限，急需开发和完善。此外，进一步研究有关的化学发光反应机制，提高化学发光效率也是很有必要的。

图3 化学发光免疫分析法用于高灵敏检测猪圆环病毒2型[25]Fig.3 Schematic of ultrasensitive CLIA for the detection of PCV2[25]

2.4 表面增强拉曼散射传感

表面增强拉曼散射具有超高的灵敏度、高选择性、高分辨率、无需样品预处理以及对检测样品没有损伤等优点，在疾病诊断和生物分析中得到了越来越广泛的应用。罗志辉等[32]基于多枝Au纳米粒子的高SERS活性，以其为SERS增强基底，并用拉曼标记分子p-巯基苯甲酸(p-MBA)对其进行标记，开发了单一组分SERS传感器，并将其用于PCV2的检测。这种SERS探针制备简单、不需要太复杂的修饰，为SERS传感器用于动物病毒的检测提供了基础。虽然这类探针已经得到了较为广泛的应用，但是由于稳定性和灵敏度方面还存在一些问题，限制了其更广泛的应用。罗志辉等[33]对原来单一组分SERS探针进行改进，利用种子生长法，以具有强SERS活性的p-巯基苯胺(p-ATP)包裹的双金属Au/Ag核壳纳米粒子构建SERS探针，用于猪链球菌病(SS2)的标志物溶菌酶释放蛋白(MRP)的检测，从而为SS2的确认提供有用的诊断信息(图4)。这种方法检测灵敏度高、快速，可应用于各种疾病标志物的实际检测，为早期诊断提供科学依据。

3 动物疾病的电学传感

3.1 电化学传感

图4 Au/Ag核壳纳米粒子SERS探针的构建及其用于MRP检测[33]Fig.4 Schematic of SERS sensor based on pATP embedded Au/Ag core-shell nanostructures for detection of MRP[33]

电化学分析法具有成本低、功耗低、灵敏度高以及兼容性好等优点。而纳米技术与电化学技术的交叉融合，更促进了电化学传感技术的发展[48]。例如，利用磁性纳米材料与磁性电极结合，可以大幅度提高生物分子或信号标签在电极表面的固定效率和稳定性，减少了传感器构建过程的复杂性和不确定性[49]。李芳等[26]选用磁珠和Au纳米粒子分别作为捕获剂和电化学信号标签，利用抗原-抗体-二抗结合模式，构建出基于自制磁性电极的电化学免疫传感器，实现了快速、灵敏地检测猪血清中的PrV抗体，适用于临床诊断。

然而，抗原、抗体、DNA等电子惰性材料对电极有一定的封闭效应，不利于电子的传递，导致电化学信号较弱，一定程度上会降低方法的检测灵敏度[50]。因此，提高电极与电活性物质间的电子传递速率以及降低惰性材料对电极的封闭效应有利于电化学信号的增强。Huang等[27]利用导电性好、比表面积大、电子转移速度快的石墨烯，构建了一种基于石墨烯和Ag纳米粒子信号放大的“三明治”式电化学传感器，大幅度提高电子的传递速率，减少抗原抗体对电极的封闭效应，实现了对禽流感病毒H7的超灵敏检测。Dong 等[28]首次将DNA四面体探针引入到电化学传感器中，避免了单链DNA钝化电极的问题，设计了DNA四面体纳米探针，用于检测禽流感病毒H7N9。该方法具有较好的选择性、灵敏度和稳定性，为DNA四面体支架用于基因水平上检测病毒或病原体提供了基础。

3.2 电化学发光传感

电化学发光也叫电致化学发光(ECL)，是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应[51]。实现电化学发光传感技术信号放大主要从以下三个层面：增强基底、提高单个信号标签的发光效率以及增加单位空间内的信号标签数目。原位产生共反应剂是一种较好的提高信号标签发光效率的策略。王海军等[29]利用仿双酶原位产生共反应剂过二硫酸盐，大幅度提高了信号标签的发光效率，实现了SS2的高灵敏检测。然而，单单提高发光效率，灵敏度不能得到很大提高，邵康等[30]从信号放大的三个层面，以石墨烯-金的基底增强效应，多孔SiO2微球的载体作用以及生物素-链霉亲和素“生物桥”作用构建了协同信号放大的电化学发光免疫传感器，提出了一种“伸展-装载-生长”的通用放大策略，并首次将其应用到PrV抗体的检测中(图5)。该方法灵敏度极高且可靠，尤其是提出的一种通用的可调谐信号放大策略对信号放大型传感器的构建有一定的指导和借鉴意义。

降低背景干扰是提高电化学发光传感准确度的重要方面。当前的电化学发光传感器的发射波长大多位于可见光区域，其电化学发光信号很容易受到生物样品本身的背景信号干扰，近红外区域的电化学发光可以解决这些问题。邵康等[31]首次将多孔的Au/PtAu双金属异质结纳米管作为催化剂引入到ECL传感器中，利用CdTe/CdS QDs作为近红外发射器，选用碳纳米管作为增强基底，铂金纳米管作为类酶催化剂，并基于环糊精和金刚烷主客体识别作用进行信号放大，构建了近红外区信号放大的“三明治”式ECL传感器，对PRRSV进行检测。该传感器具有高的灵敏度及稳定性，推动了近红外ECL传感器的发展。此外，单信号电化学发光传感器容易受到外界环境的影响，导致信号产生波动或不稳定，从而影响检测结果。而双信号比率型检测可以通过自校准作用消除这些影响，使检测结果更准确可靠[52 - 54]。不过可惜的是，到目前为止，比率型电化学发光传感器还未被应用到动物疾病的检测中。

纵观以上检测方法，其在动物疾病检测中各有优缺点。几种检测方法的比较如表1所示。比色法快速简单，但误差较大；荧光分析法提高了检测灵敏度，但易于受到其他物质的干扰，导致应用受限；电化学及电化学发光方法具有高度的选择性和灵敏性，但其重现性和稳定性还有待改进，且非特异性吸附等问题仍有待解决；表面增强拉曼散射技术作为一种新的检测技术，大大提高了检测灵敏度，但拉曼基底的制备方面仍有待提高。

表1 比较检测动物疾病的不同方法

5 总结与展望

近年来，随着人们生活水平的提高，健康意识逐渐增强，而动物疾病的发生，不仅对畜牧业造成巨大经济损失，还会严重危害人类健康。因此，越来越多的科研工作者致力于开发简单快速且灵敏高效的光电分析技术，用于早期诊断动物疾病。尽管针对动物疾病的检测已经发展出许多光电传感策略，并取得了一定的进展，但其在实用性及准确性等方面仍需做出一些努力。一方面，设计高灵敏度、可重复使用的光电传感技术，可明显降低成本；实现检测的自动化、微型化，有助于实时实地检测动物疾病，为应用于临床提供了可能。另一方面，降低非特异性吸附，排除外界环境条件等因素干扰，提高识别特异性和选择性，为动物疾病的精准检测提供基础。此外，开发新型的传感模式有利于深入研究疾病的致病机理，做到从基因水平研究疾病，推动基因检测在动物疾病检测中的发展。实现未来检测动物疾病传感器的微型化、功能化、智能化、集成化仍是一大挑战，有待于科研工作者的共同努力。