细胞与活体中小分子荧光成像研究进展

孔凡鹏， 时晓慧， 舒迎争， 范楠楠， 梁慕文， 唐 波

(分子与纳米探针教育部重点实验室，山东师范大学化学化工与材料科学学院，山东济南 250014)

1 引言

细胞与活体中的小分子(Rective Small Molecules,RSMs)通过维持分子网络的动态平衡来实现对生命活动的调控，它们中的活性小分子变化行为与疾病的发生和发展密切相关。准确检测这些生物活性小分子，探究它们参与的相关信号转导过程，对剖析重大疾病发生和发展的分子机制以及诊疗意义重大。在众多成像技术中，荧光成像技术具有许多优点[1 - 3]，如：可达到单分子检测的高灵敏性、可控,可实现对亚细胞器及纳秒级的时空分辨。近年来，越来越多的结构多样、灵敏度高、选择性好的小分子荧光探针被应用于活细胞与活体内活性分子的成像检测[4 - 6]。

2 国内外研究现状

2.1 还原性活性小分子的荧光检测

谷胱甘肽(GSH)是细胞内含量最丰富的小分子巯基化合物，在清除体内毒素和自由基的过程中发挥着关键作用[9]。GSH含量的异常可能导致癌症、衰老、心血管疾病以及其他病症。Kim研究组[10]设计合成了能定位于线粒体的近红外荧光探针1用于特异性检测GSH(图1)。由于硝基偶氮苯对花菁母体的荧光猝灭效应，该探针本身无荧光，GSH使硝基偶氮苯从花菁母体上解离，从而使近红外荧光恢复。在HeLa细胞中进行的共聚焦成像显示，探针作为线粒体内GSH示踪剂，其性能优于目前商业化的GSH探针和线粒体定位染料。Yoon研究组[11]设计合成了一种以花菁为母体，5-二甲氨基-丹酰胺作为识别基团的特异性检测GSH的近红外荧光探针2(图1)，并成功应用于对小鼠体内的肝脏、肾脏、脾脏和肺等器官中GSH水平变化实时监测。

图1 探针1和2的结构及其响应机理Fig.1 Structures and response mechanisms of probes 1 and 2

杨清正研究组[12]设计出一种以氯代BODIPY为母体的比率型荧光探针3(图2)，该探针中的氯原子首先与巯基发生巯基-卤素亲核取代反应生成硫代BODIPY，Cys和Hcy结构中的氨基与硫原子发生重排形成氨基取代的BODIPY，而GSH与探针只发生巯基-卤素亲核取代反应形成硫代BODIPY，两种不同取代的BODIPY呈现不同的光物理性质，从而实现探针对GSH 的特异性识别。Li研究组[13]以乙二醛腙为反应位点设计合成了一种近红外荧光探针4(图2)。GSH与探针中的醛基进行加成反应，随后内酰胺水解开环形成具有强荧光的部花菁。而Cys或Hcy能与探针形成稳定的五环或六环杂环，无法使内酰胺开环，部花菁荧光不能恢复，从而实现探针对GSH的特异性检测。

图2 探针3和4的结构及其响应机理Fig.2 Structures and response mechanisms of probes 3 and 4

H2S是继NO和CO之后的第三种气体信号分子。研究发现H2S在许多生理过程中，例如在调节血压、传递神经信号等方面发挥着重要作用[14]。基于H2S可将叠氮还原为氨基的原理， Pluth研究组[15]设计合成了两种荧光探针5和6(图3)用于特异性检测H2S。在H2S的作用下探针5结构中的叠氮还原为氨基，从而使内酯螺环结构开环，导致荧光显著增强，利用该探针实现了斑马鱼体内H2S的可视化荧光成像。探针自身基本没有荧光，与H2S反应后生成荧光团，同时释放氧硫化碳，氧硫化碳在碳酸酐酶的作用下转化为H2S。探针6区别于以往探针的最大特点在于反应消耗一分子H2S的同时释放一分子H2S，从而保持生物样品中H2S的浓度不变。

图3 探针5和6的结构及其响应机理Fig.3 Structures and response mechanisms of probes 5 and 6

Bea研究组[16]设计合成测H2S浓度变化的比率型双光子荧光探针7(图4)。 并利用双光子成像实现了对星形细胞和脑切片中由胱硫醚-β-合成酶催化产生的内源性的H2S的监测。基于H2S与碳氮双键的亲核加成反应，郭子建研究组[17]设计合成了一种比率型荧光探针8该探针由香豆素和部花菁组成，在生理pH环境下，HS-与探针中碳氮双键发生亲核加成反应，使得探针652 nm处的特征发射峰荧光明显下降，510 nm处特征发射峰荧光显著增加，从而实现了探针对H2S的比率荧光检测。采用该探针实现了对MC-7细胞线粒体中内源性H2S的可视化成像。基于串联亲核加成反应，唐波研究组[18]设计合成了一种以花菁为荧光母体的近红外比率型H2S荧光探针9(图4)。探针在780 nm处有荧光发射，H2S对醛基亲核加成后，生成的巯基中间体进一步与酯羰基发生亲核加成反应，释放出酮式花菁，在625 nm处出现新的荧光发射峰。探针在625nm和780nm的荧光强度比值I625/I780与H2S浓度呈现良好的线性关系。作者利用该探针，实现了对活细胞中内源性H2S的比率荧光成像检测。

图4 探针7，8和9的结构及其响应机理Fig.4 Structures and response mechanisms of probes 7,8 and 9

图5 探针10和11的结构及其响应机理Fig.5 Structures and response mechanisms of probes 10 and 11

过硫化氢(H2S2)及多硫化氢(H2Sn，n>2)是H2S参与生命体内氧化还原反应的产物。因此，设计可选择性检测多硫化物的荧光探针具有非常重要的意义。Xian研究组[19]设计合成了首个可检测H2S2的荧光探针10(图5)。探针本身荧光微弱，当H2S2存在时，探针结构中的巯基与H2S2反应生成含有-S-SH的中间体，该中间体进一步发生分子内环化，形成含有二硫键的五元环脱去，释放出荧光团，致使荧光显著增加。以此探针实现了对H9C2细胞和HeLa细胞中H2S2的荧光成像检测。基于多硫化物H2Sn含有两个-SH的结构特性，Xian研究组[20]设计合成了以荧光素为母体，含有两个亲电反应基团的荧光探针11(图5)。探针本身基本没有荧光，当H2S2存在时，巯基首先与氟原子发生亲核取代反应，形成含有-S-SH结构的中间体，而中间体中的-SH可与酯羰基发生亲核加成反应，然后消除含有二硫键的五元环，释放出荧光素，使得荧光显著增强。利用该探针实现了对HeLa细胞中H2S2的可视化荧光成像检测。

图6 探针12和13的结构及其响应机理Fig.6 Structures and response mechanisms of probes 12 and 13

硒在许多代谢过程中都起着至关重要的作用[24]，研究表明硒的生理功能依赖于其在生物体内存在的化学形态[25]。硒主要是以硒代半胱氨酸参与体内蛋白质、酶和辅酶的合成，进来研究表明硒对于癌症具有预防和治疗作用。唐波研究组[26]设计合成了一种以部花菁为荧光基团，苯并硒二唑为响应基团的荧光探针14(图7)。在pH=7.4的生理条件下，探针结构中的苯并硒二唑与硒醇反应，生成邻苯二胺供电子基团，荧光显著增强，实现了对活细胞中硒醇的可视化荧光成像，并研究了Na2SeO3诱导的HepG2细胞凋亡与硒醇含量的关系。H2Se是体内硒元素重要的代谢中间体，涉及多种病理生理学过程。唐波研究组[27]设计合成了一种近红外荧光探针15(图7)在细胞及活体内实现对H2Se的荧光成像。H2Se打断探针结构中的硒氮键，将苯并硒二唑结构转变为邻苯二胺供电子体，致使荧光增强，荧光强度随着H2Se浓度在一定范围的增加而显著加强，且两者具有良好的线性关系。作者采用该探针并初步揭示了在乏氧条件下亚硒酸钠的抗癌机制为非氧化胁迫作用。

图7 探针14和15的结构及其响应机理Fig.7 Structures and response mechanisms of probes 14 and 15

硫氧还蛋白还原酶(TrxR)是一种重要的硒酶，房建国研究组[28]设计合成了以萘酰亚胺为荧光母体，环内二硫键为识别基团的荧光探针16(图8)，用于检测TrxR的酶活性。探针本身荧光很弱，与TrxR反应后，S-S键被-SeH进攻，使得S-S键断裂，进而与酯羰基发生分子内的环化，形成的五元环脱落，释放出萘酰亚胺荧光母体，利用该探针实现了对HepG2细胞内硫氧还蛋白还原酶的可视化成像。在检测硫氧还蛋白还原酶基础上，房建国研究组[29]设计筛选出了一种以香豆素为荧光母体的检测硒醇的荧光探针17(图8)。2,4-二硝基苯磺酰基作为缺电子的荧光猝灭基团与香豆素相连，使得探针本身荧光猝灭，在pH=7.4的生理条件下，R-Se-亲核进攻探针的响应基团，致使2,4-二硝基苯磺酰基脱落，香豆素的荧光恢复，实现了HepG2细胞内源性硒醇的可视化成像分析。

图8 探针16和17的结构及其响应机理Fig.8 Structures and response mechanisms of probes 16 and 17

2.2 氧化性活性小分子的检测

活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)主要包括羟基自由基、过氧化氢、单线态氧、羟基自由基和超氧阴离子等，它们在细胞信号转导[30]和免疫[31]作用中起着重要的作用。然而,ROS浓度水平过高会破坏机体内生物分子，引起多种疾病[32]。

在诸多活性氧中，·OH氧化能力最强，能够通过将蛋白质、糖类降解，使脂质过氧化和DNA断裂，对细胞产生不可修复的损伤，影响生物体的生理学和病理学过程，进而引发各类疾病。Turro研究组[33]以2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧自由基为识别基团设计合成了特异性检测羟基自由基的荧光探针18(图9)。探针结构中的氮氧自由基能捕获·OH与二甲亚砜(DMSO)反应后产生的·CH3，导致罗丹明开环，荧光恢复，实现了对·OH的间接测定。利用该探针，实现了对PMA刺激下HepG2细胞线粒体中·OH的荧光成像。Tae 研究组[34]设计了一个以酰肼为识别基团的罗丹明类荧光探针19(图9)用于特异性检测·OH，并成功应用于A549细胞和RAW264.7细胞中·OH的荧光成像。张忠平研究组[35]基于荧光素染料设计合成了能区别HClO和·OH的荧光探针20(图9)。 该探针与HClO反应时，内酰胺螺环打开，呈现荧光素的绿色荧光；而与氧化性更强的·OH反应时，荧光素中苯环被氧化开环，形成青色荧光产物。作者实利用该探针现了对活细胞线粒体中HClO和·OH的荧光成像检测。

图9 探针18,19和20的结构及其响应机理Fig.9 Structures and response mechanisms of probes 18,19 and 20

基于PET和形成分子间氢键的机理，刘志洪研究组[36]以酰肼为识别位点设计合成了检测丙二醛的荧光探针21(图10)，并利用该探针，实现了对H2O2刺激条件下HeLa细胞中丙二醛浓度变化的荧光荧光成像。林伟英研究组[37]以肼为识别基团设计合成了靶向线粒体检测丙二醛荧光探针22(图10)，并实现了HeLa细胞中丙二醛的荧光成像。

图10 探针21和22的结构及其响应机理Fig.10 Structures and response mechanisms of probes 21 and 22

图11 探针23和24的结构及其响应机理Fig.11 Structures and response mechanisms of probes 23 and 24

图12 探针25,26和27的结构及其响应机理Fig.12 Structures and response mechanisms of probes 25,26 and 27

基于中位吡咯基团对BODIPY母体的“增强型”PET效应和能被HClO的选择性氧化，彭孝军研究组[43]设计合成了 “增强型PET”的HClO荧光探针28(图13)，可用于超灵敏(检测限为0.56 nmol)、快速、高选择性地检测癌细胞内本真次氯酸的含量。该探针被用于对癌细胞内HClO和由伊利司莫诱导MCF-7细胞HClO浓度波动进行成像。HBrO的缺乏会影响胶原蛋白的活性，进一步影响动物的发育，唐波研究组[44]设计合成了一种极易商品化的小分子荧光探针29用于HBrO超灵敏检测(图13)。该探针通过HBrO催化产生共轭度扩增产物，极大提高信噪比，首次成功区分了正常细胞与肿瘤细胞内HBrO水平的差异，以及斑马鱼不同发育期体内HBrO分布的状况。因此，探针29将成为一种有前景的实用探针材料用于HBrO调控胶原蛋白活性及胶原蛋白过量表达的生物学效应研究。基于硼酸酯和硫内酯双识别基团，Yoon研究组[45]设计合成了一种对HClO特异性响应的荧光探针30(图13)。该探针只有在ClO-作用下，发生芳基硼酸酯和硫内酯水解，形成荧光素。利用该探针，实现了对果蝇体内ClO-荧光成像。马会民研究组[46]以硫内酯为识别基团构建了能定位于线粒体ClO-的荧光探针31(图13)。并对处于细菌感染期的巨噬细胞的线粒体中的ClO-进行了荧光成像。

图13 探针28，29，30和31的结构及其响应机理Fig.13 Structures and response mechanisms of probes 28,29,30 and 31

基于硒化物消除反应，江华研究组[47]设计合成了两种基于的对HClO特异性响应的荧光探针32(图14)，并成功应用于Raw264.7细胞中HClO的荧光成像。基于PET机理，以硒醚为识别基团，唐波研究组[48]设计合成了一种用于可逆检测HClO的双光子荧光探针33(图14)。并成功地对在斑马鱼和小鼠中的HClO水平进行了双光子荧光成像。Yoon研究组[49]以咪唑啉-2-硫酮为识别基团设计合成了对ClO-特异性响应的荧光探针34(图14)，并利用双光子荧光成像技术，对活细胞和组织中ClO-进行的成像分析。

图14 探针32,33和34的结构及其响应机理Fig.14 Structures and response mechanisms of probes 32,33 and 34

活性氮(RNS)是生物体内另一类重要氧化性活性物种[50 - 51]，其主要包括NO、NO2、过氧亚硝酰、硝酰等。RNS在各种生理和病理过程中起重要作用，如NO是重要的气体信号分子，在调节血压、传递神经信号等方面发挥着重要作用[52 - 53]；过氧亚硝酰能氧化脂质、蛋白质、碳水化合物和DNA，从而导致心血管疾病、神经性疾病、炎症和癌症产生。因此，在细胞与活体内特异性检测RNS具有重要的意义。Nakagawa研究组[54]设计合成了第一个不含金属离子的检测活细胞内硝酰的分子荧光探针35(图15)。通过三苯基膦与硝酰的反应形成氮杂内鎓盐导致罗丹明荧光团的开环，产生强荧光。钱旭红研究组[55]设计合成了用于检测过氧亚硝基阴离子的三通道荧光探针36(图15)。在过氧亚硝氧化作用下，经历一个橙色发光中间体37后，形成红色的试卤灵衍生物38，其他ROS和RNS对于过氧亚硝酰的检测均不产生干扰。该探针已成功地应用于活细胞内源性过氧亚硝酰阴离子的荧光成像。

图15 探针35和36的结构及其响应机理Fig.15 Structures and response mechanisms of probes 35 and 36

2.3 金属离子的检测

在生物体内，钾、钠、钙、镁、铁、铜、锌等金属离子广泛参与生命过程，它们是维持生命活动所必需的元素[56]。铜是一种必须的微量元素，它常以辅基的形式参与细胞内多种重要的代谢途径。如在赖氨酸氧化酶参与结缔组织的形成和胺原交联，超氧化物歧化酶清除体内自由基，细胞内铜离子调控这些酶的活性，其浓度影响这些酶的功能的发挥[57 - 58]。Taki研究组[59]设计了第一个反应型的Cu(Ⅰ)荧光探针39(图16)， Cu(Ⅰ)催化氧化使探针结构中苄基醚C-O键断裂，导致荧光素荧光恢复。Chang研究组[60]基于与铜离子螯合的硫醚基团和线粒体定位基团三苯基鏻设计了荧光探针40(图16)，该探针能有效地检测线粒体内的铜离子浓度变化，并成功应用于监测抗坏血酸盐诱导C6细胞中Cu(Ⅰ)的浓度波动。Chang研究组[61]还设计了一种基于杂化荧光素Cu(Ⅱ)荧光探针41(图16)，探针结构中三氟甲基可使芳基-芳基旋转的非辐射衰减最小化，进而提高荧光团的量子产率。研究者利用该探针研究了Cu(Ⅱ)在神经系统中发挥的生理作用。

图16 探针39,40和41的结构式Fig.16 Structures of probes 39,40 and 41

K+是生物体中最为丰富的金属离子之一， K+除了与Na+一起维持细胞内外渗透压及电解质平衡，在肌肉收缩、神经传递、肾脏功能等诸多方面发挥至关重要的作用[62]。人体中K+的失衡是许多疾病的诱因，如心脏病、糖尿病、癌症等。因此，急需发展高选择性、高灵敏度的检测细胞及活体中K+的荧光探针。Meldrum研究组[63]报道了一个高选择性检测线粒体中K+的荧光探针42(图17)。探针结构以氮杂穴状配体作为K+识别基团，以亲脂性三苯基膦阳离子结构定位线粒体，以BODIPY作为荧光团。该探针能很好地响应30～500 mmol/L的K+，且pH值及其他各种金属离子不干扰。作者利用该探针成功可视化了HeLa及U87MG细胞在离子霉素诱导下线粒体中K+的外流。

唐波研究组[64]设计合成了一个近红外荧光探针43(图17)，结合微流控芯片技术，实现了单个正常/肿瘤细胞中Na+和K+的同时定量分析。探针主体结构为氮杂BODIPY结构，其空腔结构识别Na+、K+离子。结合微流控芯片技术，该探针能准确定量检测单个HepG2细胞内Na+和K+的浓度。方法被用于检测正常/肿瘤细胞内Na+和K+的浓度比率，结果表明肿瘤细胞具有更高的Na+/K+比值。最后，该探针被成功应用于检测白藜芦醇诱导的HepG2细胞凋亡过程中Na+和K+的浓度变化。

图17 探针42和43的结构式Fig.17 Structures of probes 42 and 43

铁是人体中含量最丰富的过渡金属，主要分布在血红细胞中。铁能与生物分子产生各种键合作用，作为活性中心形成酶、激素等，从而发挥电子转移、载氧等重要的生理功能[65 - 66]。Chang研究组[67]设计了一种高灵敏度、高选择性的Fe2+催化氧化反应型荧光探针44(图18)，用于检测活细胞中的Fe2+。探针44加入Fe2+后在有氧环境中发生氧化脱烷基化作用，C-O键断裂，荧光素共轭体系恢复。该探针对Fe2+具有特异性，并成功应用于检测铁调素、抗坏血酸诱导的肝细胞中Fe2+浓度变化。基于光诱导电子转移(PET)机理，Chang研究组[68]还发展了一种高灵敏度、高选择性的Fe2+荧光比率成像探针45(图18)。探针以1,2,4-三氧杂环戊烷为识别基团，以5-氨甲基荧光素(5-AMF)为荧光供体和花菁(Cy3)为荧光受体，通过三氧杂环与Fe2+发生芬顿反应前后呈现FRET比率信号，实现对Fe2+的荧光比率成像。利用该探针，作者研究了正常人类乳腺上皮细胞(HEK 293T)和人类乳腺癌细胞(MCF-10A)、人类骨癌细胞(MDA-MB-231)的比率荧光成像，验证了肿瘤细胞中Fe2+的浓度变化幅度超过正常细胞。

图18 探针44和45的结构及其响应机理Fig.18 Structures and response mechanisms of probes 44 and 45

2.4 pH值荧光探针

细胞内稳定的pH对有机体正常生理功能的维持至关重要[69 - 70]， pH失衡会导致细胞生长和分化异常、细胞功能紊乱，进而影响到神经系统以及诱发多种疾病。唐本忠研究组[71]通过将四苯乙烯与部花菁偶联，设计合成了一种聚集诱导(AIE)型的pH荧光比率探针46(图19)，并将其成功应用于HeLa细胞溶酶体内pH的荧光比率成像。

图19 探针46的结构及其响应机理Fig.19 Structures and response mechanisms of probe 46

基于可定位于溶酶体的吗啉基团，马会民研究组[72]设计合成了近红外荧光比率pH探针47(图20)。并利用该探针，实现了热休克情况下MCF-7细胞溶酶体内pH的变化的荧光成像，并证明热休克会引起溶酶体pH值的增加，且这一过程在活细胞中是不可逆的。Kim研究组[73]基于苯并咪唑设计合成了能够检测酸性pH值变化的双光子荧光比率探针48(图20)，并对HeLa细胞溶酶体内和小鼠大脑组织中pH值进行了双光子成像。

图20 探针47和48的结构及其响应机理Fig.20 Structures and response mechanisms of probes 47 and 48

Cho研究组[74]利用嘧啶上N原子质子化设计合成了双光子比率pH荧光探针49(图21)，并对人的胃和食管组织的pH变化进行比率成像，成功地区分了正常的食管和发炎的食管。Kim研究组[75]将对酸性pH值敏感的罗丹明和对碱性pH值敏感的荧光素相连合成了对宽范围pH(3～10)检测的荧光探针50(图21)。作者利用该探针发现细胞的氧化还原平衡可以调控溶酶体内的pH。

图21 探针49和50的结构及其响应机理Fig.21 Structures and response mechanisms of probes 49 and 50

3 展望

综上，随着化学生物学和医学迅速发展，对应用于复杂的细胞及活体中荧光成像的小分子探针的性质和功能提出更高的要求。虽然与生理病理相关的重要活性小分子的荧光探针相继被开发，但细胞与活体内大部分活性小分子含量低、活性高、分布状况各异、合成与代谢迅速、生物效应多样，这些特性对荧光探针的发展提出了更高的要求和新的挑战。为了更能真实地反映生命的过程，结合荧光成像技术的发展，今后用于细胞与活体内活性小分子成像的荧光探针研究将会在今后聚焦于以下几个方面：

(1)需发展量子产率高，波长位于近红外(650～900 nm)或近红外二区(NIR-Ⅱ，1 000～1 700 nm)的荧光探针；或设计具有更大的吸收截面值的双光子荧光探针，从而降低光在穿透生物组织中的散射及生物体自发荧光的影响，提高成像深度和空间分辨率，实现探针在活体成像中的成功应用。

(2)在保证识别特异性的前提下，发展新的识别机理，通过探针与活性小分子反应后，共轭程度扩展，荧光发射波长红移，降低检测背景，提高信噪比，实现对极低含量水平活性小分子的超灵敏检测。

(3)在探针分子中引入与特定蛋白结合的锚定基团，提高探针在细胞与组织内驻留时间问题，实现对复杂生理和病理过程的长时间荧光成像。

(4)发展与活性小分子瞬时响应、动态可逆结合的荧光探针，精确示踪细胞与活体内分子事件过程。

相信，随着越来越多性能优异的荧光探针的涌现，会使人们对生物活性小分子的认识与了解会更加全面深刻，会对小分子参与的重要生命过程及其对重大疾病发生发展的影响研究带来新的机遇和新的希望。