N-辛基-2-吡咯烷酮甲磺酸盐离子液体动态涂敷毛细管电泳分离碱性蛋白质

李 昀， 郭小峰， 周晓海， 王 红

(生物医学分析化学教育部重点实验室，武汉大学化学与分子科学学院，湖北武汉 430072)

蛋白质是氨基酸经脱水缩合形成酰胺键连接而成的生物大分子，是生命体的重要组成部分和生命活动的基础。蛋白质的分离分析在食品安全、临床医学、生物医药、遗传免疫和生物化学等领域有着重要意义。毛细管电泳(Capillary Electrophoresis，CE)具有高效、快速、样品和溶剂用量少、灵敏度高等特点，是分离分析蛋白质等生物大分子的强有力工具[1 - 4]。然而，石英毛细管内壁存在大量硅羟基。在pH大于3.0的溶液中硅羟基解离，使毛细管内壁带负电，在毛细管内壁形成带负电荷(Si-O)的吸附点。当背景电解质pH小于蛋白质等电点时，这些负电荷会对带正电荷的蛋白质产生静电吸附[5]。此外，毛细管内壁与蛋白质分子中的疏水区域存在疏水作用[5]。这些相互作用将导致CE分离蛋白质时出现峰形展宽乃至拖尾，导致分离效率降低、迁移时间重现性下降等问题，在相当程度上限制了CE在生物医学分析方面的应用。为解决这一问题，对毛细管内壁进行修饰是一个有效途径，可以屏蔽毛细管内壁的硅羟基，并使石英表面的性质发生转化(通常转化为亲水性表面)[1]。目前，通常采用的修饰方法主要有动态涂敷、物理吸附或化学键合[2]。动态涂敷通过在缓冲溶液中加入与毛细管壁具有强烈相互作用的涂层物质，从而形成动态涂层，具有制备简单快速、涂层可再生等优势，是CE分离蛋白质的一个理想方案[2]，目前常采用的动态涂敷试剂主要是中性高分子聚合物和阳离子表面活性剂[6]。

离子液体(Ionic Liquids,ILs)蒸气压小，不挥发，电导率强，粘度低，性质稳定，对无机物和有机物有良好的溶解性，在电化学[7 - 8]、有机合成[9 - 10]、萃取分离[11 - 12]等化学领域得到了广泛的应用。在CE中，ILs常作为动态涂敷试剂、电泳缓冲液添加剂或者共价键合涂层试剂，通过物理吸附、共价键合等作用力把ILs的阳离子吸附或者键合到在毛细管壁上，在毛细管内表面形成一均匀的涂层，对毛细管内壁进行改性修饰，既可以用于水相，也可以用于非水相分离不同的物质，如氨基化合物[13]、抗生素[14]等物质。

然而，目前将ILs用于CE分离蛋白质的相关研究和报道很少。Jiang等采用1-烷基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(1E-3MI-TFB)离子液体作为毛细管动态涂敷试剂和缓冲溶液添加剂，对4种碱性蛋白进行了分离，理论塔板数为104N/m左右[15]。Wu等用1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸离子液体(1B-3MI-TFB)用作毛细管电泳的动态涂敷试剂和唯一运行电解质，对3种碱性蛋白和2种酸性蛋白质进行了分离，得到了较高的分离效率和重现性[16]。Li等首次将聚合物离子液体用于毛细管电泳，对溶菌酶、细胞色素c、α-胰蛋白酶原A和核糖核酸酶A四种碱性蛋白质进行了分离[17]。我们课题组将N-甲基吡咯烷酮磺酸盐离子液体作为动态涂敷试剂用于CE分离碱性蛋白，四种碱性蛋白质15 min内实现基线分离，理论塔板数在2.0～4.5×105N/m[18]。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

AgilentG1600A3D毛细管电泳仪(USA,Aglent Technology);Delta-320酸度计(梅特勒-托利多中国(上海)有限公司)；AL 104分析天平(梅特乐-托利多中国(苏州)有限公司)；熔融石英毛细管：50 cm×75 μm，有效长度为41.5 cm(河北永年锐沣色谱器件有限责任公司)。

图离子液体的分子结构Fig.1 The structure ionic liquid

1.2 毛细管电泳动态涂敷及蛋白质分离条件

2 结果讨论

2.1 离子液体动态涂敷的机理

使用离子液体作背景电解质时或者作为背景电解质添加剂时，离子液体的有机阳离子会通过静电引力动态吸附到毛细管内壁,从而改变毛细管内表面的电荷。具有长烷基链的N-辛基-2-吡咯烷酮静电吸附于毛细管内壁后，由于其表面活性作用，可使毛细管内壁覆盖更为完全。在分离时，带正电的碱性蛋白质与涂敷在毛细管内壁的吡咯烷酮阳离子产生静电排斥，同时毛细管内壁被N-辛基-2-吡咯烷酮覆盖，避免了由蛋白质与毛细管内壁的直接接触引起的其它相互作用，从而改善蛋白质的CE分离效果。

2.2 离子液体动态涂敷分离碱性蛋白质的研究

图2 NaAc-HAc缓冲体系中离子液体浓度对溶菌酶分离效果的影响Fig.2 Effect of ionic liquid concentration in NaAc-HAc buffer on separation of lysozyme(1 mg/mL)Buffer:10 mmol/L NaAc-HAc(pH=4.5);voltage:25 kV;injection:hydrodynamic,50 mbar,4 s;detection:214 nm;temperature:25 ℃. concentration:(a) 0 mmol/L;(b) 1 mmol/L;(c) 2.5 mmol/L;(d) 5 mmol/L;(e) 7.5 mmol/L.

图3 Tris-HCl缓冲体系中离子液体浓度对溶菌酶分离效果的影响Fig.3 Effect of ionic liquid concentration in Tris-HCl buffer on separation of lysozyme(1 mg/mL)Buffer:10 mmol/L Tris-HCl(pH=4.5);voltage:20 kV;injection:hydrodynamic,50 mbar,4 s;detection:214 nm;temperature:25 ℃. concentration:(a) 1 mmol/L;(b) 2.5 mmol/L;(c) 5 mmol/L;(d) 7.5 mmol/L.

图4 优化分离条件下三种碱性蛋白质分离的电泳图Fig.4 Electropherogram of three basic proteins under optimized separation conditionsBuffer:10 mmol/L Tris-HCl(pH=4.5) containing kV;injection:hydrodynamic,50mbar,4 s;detection:214 nm;temperature:25℃.Peaks:(1) lysozyme(0.33 mg/mL);(2) cytochrome c(0.33 mg/mL);(3) α -chymotrypsinogen A(0.33 mg/mL).

2.2.3分析性能在优化条件下得到了三种碱性蛋白质的最佳电泳谱图，如图4所示。溶菌酶、细胞色素c、α-胰凝乳蛋白酶原迁移时间的相对标准偏差(RSD)分别为4.75%、3.43%和3.61%，说明所建立的方法具有良好重现性。对三种碱性蛋白质的分离效率按照公式：N=5.54 ×(tR/W1/2)2进行了计算，其中N为理论塔板数，tR为相应蛋白质的迁移时间，W1/2为相应蛋白质信号峰的半峰宽，结果见表1。

表1 优化分离条件下三种碱性蛋白质的理论塔板数

3 结论

将同时具有阳离子表面活性剂和离子液体结构特点的N-辛基-2-吡咯烷酮磺酸盐离子液体作为毛细管电泳动态涂敷试剂，建立了简单快速分离碱性蛋白质的新方法。离子液体形成的动态涂层有效抑制了碱性蛋白质在毛细管内壁上的吸附，分离效率较高，可在8 min内实现碱性蛋白质溶菌酶、细胞色素c、α-胰凝乳蛋白酶的基线分离，表明此类结构的离子液体作为涂敷试剂在毛细管电泳分离蛋白质中具有较好的应用潜力。