响应面法优化石榴叶总酚的亚临界水提取工艺

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(中国林业科学研究院林产化学工业研究所,国家林业局林产化学工程重点开放性实验室,江苏南京 210042)

响应面法优化石榴叶总酚的亚临界水提取工艺

闫林林,郑光耀*,韦朝宽

(中国林业科学研究院林产化学工业研究所,国家林业局林产化学工程重点开放性实验室,江苏南京 210042)

本研究采用亚临界水萃取法提取石榴叶总酚,并通过响应面法优化其提取工艺参数。在单因素实验的基础上,根据响应面Box-Behnken实验设计原理,采用三因素三水平的分析法,选取提取温度、提取时间、液料比为自变量,考察其对石榴叶提取物中总酚含量的影响,并通过方差分析优化其工艺。结果表明,回归方程对实验拟合较好,可以对石榴叶中总酚含量进行很好的分析和预测;优化后的最佳工艺条件为:提取温度134 ℃、提取时间31 min、液料比52∶1 mL/g。在该条件下,石榴叶总酚含量为169.24 mg GAE/g,与预测值173.31 mg GAE/g基本一致。通过与溶剂加热回流法相比较,亚临界水提取可明显提高石榴叶总酚的含量,并缩短提取时间。

石榴叶,总酚,亚临界水提取,响应面法

石榴叶为石榴科(Punicaceae)石榴属(Punica)植物石榴(PunicagranatumL.)的叶,据《图经本草》记载“榴叶者,去咽喉燥渴,止下痢漏精,消食祛火之功效”[1]。研究表明,石榴叶含有丰富的多酚及黄酮类活性物质,如鞣花酸、没食子酸、短叶苏木酚、熊果酸等,具有抗氧化、抗肿瘤、收敛止血等功效[2-5],是潜在的天然抗氧化剂的来源。目前,石榴叶已被开发为石榴茶,具有健脾、防暑、爽心明目、抗氧化等保健作用[6]。然而,绝大部分石榴叶资源还是被作为废弃物丢弃,造成了资源的浪费。因此,对石榴叶中酚类物质的研究对于石榴资源的充分开发和利用具有重要意义。

目前,对石榴叶中酚类物质的提取,一般多采用有机溶剂或热水浸泡提取、加热回流提取、超声提取等技术,存在着耗时长、提取率低、提取溶剂污染环境等问题[1,7-9]。亚临界水提取技术是近年来发展起来的一种新兴的提取技术,具有提取时间短、高效率、绿色环保等优势,已被广泛应用于多种植物材料中酚类物质的提取[10-11]。有研究表明亚临界水萃取可以提高石榴籽中多酚的提取率[12],但是针对亚临界水提取石榴叶总酚及其工艺优化的研究尚缺乏。因此,本研究首次采用亚临界水提取法,以石榴叶提取物中总酚含量为指标,选取提取温度、提取时间、液料比为自变量,结合响应面Box-Behnken实验设计原理,优化石榴叶总酚的提取工艺,旨在为石榴叶中多酚的开发和利用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

石榴叶 采集于2016年10月,于南京市玄武区锁金北路，将采集的石榴叶用清水洗净后放置于烘箱40 ℃下干燥后,用中药粉碎机粉碎,过60目筛后,将石榴叶粉末置于-20 ℃冰箱备用；福林酚试剂(Folin-Ciocalteu reagent) 美国Sigma公司;没食子酸标准品(纯度>90%)、鞣花酸标准品(纯度>98%) 南京春秋生物工程有限公司;乙腈和甲酸 色谱级,默克公司;碳酸钠、无水甲醇等 均为分析级,国药集团。

LC-20AT HPLC-PAD液相色谱工作站 配有自动进样器(SIL-20A)、PDA检测器(SPD-20A)、柱温箱(CTO-10AS) 日本岛津;UV-2102 PC型紫外-可见分光光度计 尤尼克(上海)仪器有限公司;TGL-16C型高速台式离心机 上海安亭科学仪器厂;亚临界水萃取装置(自制),如图1所示。

图1 亚临界水萃取装置示意图Fig.1 Schematic diagram of the subcritical water system注：1:加热装置;2:物料篮;3:氮气瓶;4:萃取釜;5:冷却器;6:收集器;P:压力表;T:温度指示器;M:电机;A、B:调节阀。

1.2实验方法

1.2.1 亚临界水提取单因素实验 精确称取一定量的石榴叶粉末,置于亚临界萃取装置的萃取罐中,在不同提取温度(100～200 ℃)、提取时间(10～100 min)和液料比(20∶1～60∶1 mL/g)的条件下提取,重复提取两次后合并提取液,将所得到的提取液以4000 r/min的速度离心10 min后,取上清液定容至一定体积,备用。具体为:考察一系列提取温度(100～200 ℃)对石榴叶提取物中总酚含量及其抗氧化活性的影响,在固定提取时间为20 min,液料比为50∶1 mL/g的前提下,对石榴叶总酚进行亚临界水提取;考察一系列提取时间(10～100 min)对石榴叶提取物中总酚含量的影响,在固定提取温度为130 ℃,液料比为50∶1 mL/g条件下,对石榴叶总酚进行亚临界水提取;考察一系列液料比(20∶1～60∶1 mL/g)对石榴叶提取物中总酚含量的影响,在固定提取温度为130 ℃,提取时间为30 min的条件下,对石榴叶总酚进行亚临界水提取。

1.2.2 加热回流提取 参照文献[1]中的方法,称取一定量的石榴叶粉末,置于圆底烧瓶中,分别按照液料比50∶1 mL/g加入纯水和75%乙醇水溶液,在80 ℃的水浴中回流提取2 h,将得到的提取液以4000 r/min的速度离心10 min后取上清液,残渣再按上述条件重复提取一次,分别合并两次的提取液,定容至一定体积,备用。

1.2.3 福林酚法测定石榴叶提取物中总酚含量 采用福林酚比色法测定石榴叶提取物中总酚的含量[8]。首先制作标准曲线:精确称取没食子酸标准品0.0050 g,用蒸馏水溶解并定容于50 mL容量瓶中,配制成浓度为0.1 mg/mL的没食子酸标准液。将标准液稀释至一系列浓度后,精确量取一定体积,分别加入5 mL棕色容量瓶中,向其中各加3 mL蒸馏水,振荡摇匀,再加入0.25 mL 福林酚试剂,充分摇匀。静置1 min后,加入20% 碳酸钠溶液0.75 mL,混匀后定容至5 mL,避光静置90 min,于760 nm波长下测定吸光值。石榴叶中总酚含量的测定按上述方法进行,将样品测得的吸光值代入标准曲线,计算得出的石榴叶总酚含量用mg GAE(gallic acid equivalent)/g表示。

1.2.4 HPLC法测定石榴叶提取物中鞣花酸含量 石榴叶中含有丰富的酚类物质,其中包括大量鞣花酸[8],本研究中采用高效液相色谱(HPLC)法对石榴叶提取物中鞣花酸的含量进行测定和比较,具体色谱条件和方法参考相关文献并作改进[8]。色谱柱:Diamonsil RP-C18色谱柱(250 mm,4.6 mm,5 μm);流动相:0.2%甲酸水(A):乙腈(B)=80%:20%;等浓度洗脱;流速为1.0 mL/min;检测波长254 nm;柱温为30 ℃;运行时间为20 min。

鞣花酸标准曲线的制作:精密称取一定量的鞣花酸标品10.0 mg,配制成浓度为1.0 mg/mL的标准母液,依次用甲醇稀释成一系列浓度的标准品工作液,分别进HPLC分析。

1.2.5 石榴叶提取物的抗氧化活性评价 石榴叶提取物的抗氧化活性评价参照文献中的DPPH自由基和ABTS自由基清除实验进行[8],具体如下。

DPPH自由基清除力测定:分别取0.1 mL待测样品溶液加入5 mL离心管中,再分别向各管中依次加入0.25 mL新鲜配制的DPPH·甲醇溶液(浓度为1 mmol/L)和2 mL甲醇。将上述反应液混匀后,于室温下避光放置20 min,以纯甲醇作空白对照,于517 nm测定吸光值。DPPH自由基清除率(%)按以下公式计算,即RSA(%)=100×(A0-As)/A0,其中,A0表示0.25 mL DPPH·溶液加入2.1 mL甲醇在517 nm处的吸光值;As表示0.25 mL DPPH·溶液加入0.1 mL样品溶液和2 mL甲醇在517 nm处的吸光值。

ABTS自由基清除力测定:分别取0.15 mL待测样品溶液加入5 mL玻璃试管中,再分别向各试管中加入2.85 mL用甲醇新鲜配制的ABTS+·工作液,将上述反应液混匀后,室温下避光放置10 min,最后于734 nm处测定吸光值。ABTS+·自由基清除率按照公式计算,即RSA(%)=100×(A0-As)/A0,其中,A0表示0.15 mL甲醇加入2.85 mL ABTS+·工作液在734 nm处的吸光值;As表示0.15 mL 样品溶液加入2.85 mL ABTS+·工作液在734 nm处的吸光值。

为了对石榴叶提取物的抗氧化活性进行统一比较,首先通过测定一系列浓度的抗坏血酸(Ascorbic acid)对DPPH和ABTS自由基的清除率,制作标准曲线,得到其线性回归方程(DPPH:y=462.41x+2.6803,R2=0.9996;ABTS:y=1337.4x-3.1569,R2=0.9998);再将测得的石榴叶提取物的自由基清除率(%)代入标准曲线,从而得出石榴叶总酚提取物清除DPPH和ABTS自由基能力的抗坏血酸当量(mg Ascorbic acid/g干物质样品)。

1.2.6 响应面法优化实验设计 在单因素实验的基础上,选取提取温度、提取时间、液料比这三个因素,以总酚含量为指标,按照Box-Behnken 实验设计原理,设计3因素3水平实验(见表1),根据回归模型分析确定各因素的影响,以总酚含量为响应值(Y)作等值线图与响应曲面图,分析优化最佳提取条件,从而对石榴叶总酚的提取方法进行工艺优化。

表1 响应面分析实验因素与水平表Table 1 Factors and levels Table of response surface analysis

1.2.7 统计学分析 实验数据通过SPSS 20.0软件进行分析,并进行方差分析和多重比较,每个实验条件下,均进行3次平行操作,结果以平均值±标准差来表示。响应面分析采用Design-Expert 8.0.6软件进行,并进行模型优化。

2 结果与分析

2.1石榴叶提取物中总酚含量、鞣花酸含量标曲的绘制

以没食子酸浓度为横坐标(x),吸光值(OD)为纵坐标(y),建立标准曲线,得到福林酚法测定石榴叶提取物中总酚含量的线性回归方程:y=104.42x+0.0283,R2=0.9991,没食子酸在浓度范围0.005～0.030 mg/mL内线性关系良好。

以鞣花酸浓度(μg/mL)为横坐标(x),以峰面积(mV)为纵坐标(y)制作标准曲线,得到HPLC法测定石榴叶提取物中鞣花酸含量的回归方程:y=240390x-4612.9,R2=0.9994,鞣花酸在浓度范围为0.01～2.00 μg/mL内线性关系良好。图2是鞣花酸标准品及石榴叶提取物的高效液相色谱图。

图2 鞣花酸标准品及石榴叶提取物的高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of ellagic acidand pomegranate leaves extracts注:A:鞣花酸标品;B:石榴叶提取物。

2.2单因素实验

据文献[13]报道,提取压力在亚临界水提取过程中对提取效率的影响不大,因此本实验中暂未考虑压力变化对石榴叶总酚提取效果的影响,固定提取压力为3.0 MPa,研究提取温度、提取时间和液料比这3个因素对石榴叶中总酚含量及其抗氧化活性的影响。

2.2.1 提取温度的影响 由图3A可知,随着提取温度的升高,总酚含量逐渐升高,在100～130 ℃升高趋势较为明显,但超过130 ℃后再继续升高温度,总酚含量有明显下降的趋势。在亚临界水提取过程中,提取温度起着重要的作用,温度的升高可以提高亚临界水对提取材料中酚类物质的溶解性,可以加速分子扩散运动,达到类似于有机溶剂的效果;但是过高的提取温度也会造成其中某些热不稳定酚类物质的降解,从而导致总酚含量降低[14-15]。通过对石榴叶提取物中鞣花酸含量的测定发现,随着温度的升高(100～200 ℃),鞣花酸含量不断增加。这可能是因为石榴叶中含有的大量鞣花单宁,在高温条件下不稳定,易降解形成小分子物质如鞣花酸等[16-17],而鞣花酸在较高温度下相对稳定。但由于本实验中最高提取温度为200 ℃,温度超过200 ℃之后鞣花酸的变化趋势还有待进一步探究。为了筛选出最佳提取温度,并得到具有潜在抗氧化活性的石榴叶提取物,本研究通过DPPH自由基和ABTS自由基清除力实验比较了不同温度下石榴叶提取物的抗氧化活性(见图3B)发现,随提取温度的变化,抗氧化活性的强弱趋势与总酚含量的变化趋势有一定的相似性,而与鞣花酸含量的相关性不大,这与文献报道的结果相似[16]。因此,本实验选取130 ℃作为后续实验中的亚临界水提取石榴叶总酚的提取温度。

图3 提取温度对石榴叶总酚、鞣花酸含量(A)及其抗氧化活性(B)的影响Fig.3 Effects of extraction temperatureon the contents of total phenolic and ellagic acid(A),and antioxidant activities(B)of pomegranate leaves

2.2.2 提取时间的影响 由图4A可知,在10～30 min内,石榴叶总酚含量会随着提取时间的延长而增加;但是超过30 min后,再继续延长提取时间,总酚含量有明显降低的趋势。据文献[14-15]报道,亚临界水萃取植物中活性成分的过程是分子扩散达到固液平衡的过程,在一定提取时间内随时间的延长所溶解的活性物质不断增加;但是在萃取过程达到平衡后,随着时间的延长萃取物质的得率不会再增加,相反其中某些不稳定的物质还会发生降解,从而造成其含量的降低。通过对石榴叶提取物中鞣花酸含量的测定发现,鞣花酸含量在10～50 min内,呈逐渐升高的趋势,在超过50 min后有下降趋势。又因为石榴叶提取物的抗氧化活性与其总酚含量有正相关的关系,而与鞣花酸含量关系不大,故经综合考虑将所得到的总酚含量为最高的时间点(30 min)选为亚临界水萃取的最佳提取时间。综上,亚临界水提取石榴叶总酚不适宜采用过长的时间,在本实验中30 min为亚临界水提取石榴叶总酚的最佳提取时间。

图4 提取时间对石榴叶总酚、鞣花酸含量(A)及抗氧化活性(B)的影响Fig.4 Effects of extraction time on the contents oftotal phenolic and ellagic acid(A),and antioxidant activities(B)of pomegranate leaves

图5 液料比对石榴叶总酚、鞣花酸含量(A)及抗氧化活性(B)的影响Fig.5 Effects of solvent/solid ratio on the contents oftotal phenolic and ellagic acid(A),and antioxidantactivities(B)of pomegranate leaves

2.2.3 液料比的影响 由图5可知,总酚和鞣花酸的含量均随液料比的增大而增加,当液料比从20∶1 mL/g增加到50∶1 mL/g,总酚和鞣花酸含量也增加较快;在50∶1 mL/g 时总酚达到最高,但继续增加液料比,总酚含量不会再继续增加,但鞣花酸的含量继续增加。在前人的研究中有报道称,适度增加液料比,有利于加快介质传递过程,提高多酚提取率;但是过多的溶剂量也会造成资源浪费并增加后续去溶剂过程的工作量[18]。故经综合考虑,50∶1 mL/g为本研究中石榴叶总酚亚临界水提取的最佳液料比。

2.3响应面分析法优化亚临界提取工艺参数

2.3.1 响应面实验设计及结果 综合上述单因素实验的结果,应用Design-Expert 8.0.6 软件中的Box-Behnken实验设计原理,以石榴叶提取物的总酚含量为响应值(Y),以提取温度(A)、提取时间(B)及液料比(C)3个因素为自变量,进行3因子3水平的Box-Behnken响应面优化实验,具体实验因素和水平设计见表1,响应面实验设计方案和结果见表2。

表3 拟合回归方程的模型方差分析Table 3 Analysis variance for response surface quadratic model

注:*p<0.05表示影响显著;**p<0.01表示影响极显著。

表2 响应面Box-Behnken实验设计方案及结果Table 2 Box-Behnken experiment designand results of response surface methodology

2.3.2 模型的建立及其显著性分析 运用Design-Expert 8.0.6软件对表2的实验数据进行多元回归拟合,得到石榴叶总酚含量(Y)对提取温度(A)、提取时间(B)和液料比(C)的回归模型方程为:

Y=-2714.96+31.55 A+12.95B+22.28C+0.02AB+0.05AC+0.02BC-0.13A2-0.28B2-0.29C2。

2.3.3 各因子对石榴叶中总酚含量影响的等高线图和响应面直观图 根据回归方程得到的响应值(Y,总酚含量)对应于自变量A(提取温度)、B(提取时间)和C(液料比)构成的二维平面等高线图和三维空间曲面图,分别见图6～图8,响应曲面的形状可直观反映各因素之间的交互作用及其对响应值的影响[21]。

由图6中的可以看出,固定液料比不变,提取温度和提取时间对总酚含量的影响都比较显著,交互作用显著,且提取温度比时间对总酚含量的影响更为显著,其响应曲面弯曲程度较大,曲线较为陡峭。石榴叶中总酚含量随着提取温度的增加而增加,在达到最大之后有下降趋势,该极大值存在于响应面的顶部,也是等高线的最小椭圆的中心点。

图6 提取温度(A)及提取时间(B)影响石榴叶总酚含量的等高线图和响应曲面图Fig.6 Contour plot and response surface showingthe effects of extraction temperature and extraction timeon the total phenolics from pomegranate leaves

图7反映了固定提取温度后,提取时间和液料比之间的交互作用对石榴叶中总酚含量的影响,可见固定其中一个因素提取温度后,总酚含量会随着另外两个因素的增加而呈现出先增高后降低的趋势,在合适的条件下总酚含量达到最大值。

图7 提取时间(B)及液料比(C)影响石榴叶中总酚含量的响应曲面图和等高线图Fig.7 Contour plot and response surface showingthe effects of extraction time and solvent/solid ratioon the total phenolics from pomegranate leaves

图8反映了固定提取时间不变,提取温度和液料比对于石榴叶总酚含量的影响及其交互作用,由图8可知石榴叶总酚含量会随着提取温度和液料比的增加均呈现出先升高后降低的趋势,曲面陡峭;换言之,总酚含量在一定的提取温度和液料比下有极大值,即响应曲面的顶点和等高线中最小椭圆的中心点。

综上所述,图6～图8直观地反映了亚临界萃取过程中各因素交互作用对石榴叶总酚含量的影响。通过对图6～图8的综合比较并结合表3结果可知,3个因子对石榴叶中总酚含量的影响均达到极显著水平(p<0.01),提取温度(A)与提取时间(B)和液料比(C)之间的交互作用均达到了显著水平(p<0.05),曲面较为陡峭;而提取时间和液料比的交互作用未达到显著水平。由表3的F值可知,亚临界水提取过程中各因素对石榴叶总酚含量的影响大小顺序依次为:液料比>提取温度>提取时间。

2.3.4 最佳条件的优化和验证实验 在本实验中采用响应面软件中Optimization的优化功能,根据建立的模型进行优化,可以得到亚临界水萃取石榴叶总酚的理论最佳条件为:提取温度为133.63 ℃、提取时间为31.01 min、液料比52.00∶1 mL/g,在该条件下石榴叶总酚含量的理论预测值为173.31 mg GAE/g。为检验响应面法优化的可靠性,根据预测参数进行验证实验,考虑到操作的便利性在实际实验中将各因素调整为提取温度为134 ℃、提取时间为31 min,液料比为52∶1 mL/g,在该条件下测得石榴叶总酚含量为169.24 mg GAE/g,基本和预测值保持一致,说明响应面法可适用于对石榴叶总酚的亚临界水提取工艺进行回归分析和参数优化,且具有较高的实用价值。

表4 亚临界水提取与热回流法提取石榴叶总酚含量的比较Table 4 Comparison of total phenolics contents from pomegranate leaves obtained by subcritical water and hot reflux extraction methods

注：同一列中不同小写字母上标表示差异具有显著性(p<0.05)。

2.4亚临界水提取法与热回流提取法的比较

从表4可知,采用加热回流法使用75%乙醇和水作为溶剂提取的石榴叶提取物的总酚含量均显著低于亚临界水萃取法,且提取过程中耗时更长。而邱涛涛等[1]用有机溶剂提取的石榴叶总酚粗提物得率为16.63%,虽与本研究中亚临界水提取得到的总酚含量相差不大,但是提取过程耗时较长且耗费有机溶剂。因此可知,亚临界水提取作为一种环保、有效的提取法,可明显提高石榴叶提取物中总酚含量,可减少有机溶剂的使用且大大缩短其提取时间。

3 结论

采用亚临界水提取法提取石榴叶中的总酚,通过单因素实验对影响总酚含量的几个主要因素如提取温度、提取时间和液料比进行了研究,并在此基础上采用三因素三水平响应面分析法进行了实验。通过优化分析得到亚临界水提取石榴叶中总酚的最佳工艺条件为:提取温度为134 ℃、提取时间为31 min、液料比为52∶1 mL/g,在此条件下,亚临界水提取得到的石榴叶中总酚含量为169.24 mg GAE/g。比较亚临界水提取和传统加热回流提取法得到的总酚含量,发现亚临界水提取法可明显提高石榴叶总酚含量,并且大大缩短提取时间,是一项非常绿色环保、有效的石榴叶总酚的提取技术,具有较好的开发前景。

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Optimizationofsubcriticalwaterextractionfortotalphenolicsfrompomegranate(PunicagranatumL.)leavesbyresponsesurfacemethodology

YANLin-lin,ZHENGGuang-yao*,WEIChao-kuan

(Institute of Chemical Industry of Forest Products,CAF,Key and Open Lab.on Forest Chemical Engineering,SFA,Nanjing 210042,China)

The aim of this study was to optimize the technology parameters of subcritical water extraction for extracting total phenolics from pomegranate leaves by response surface methodology. On the basis of single-factor experiments,three-factors and three-level response surface methodology was applied to investigate the effects of extraction temperature,extraction time and solvent/solid ratio on the total phenolics contents. The results showed that model regression was significant,and the established regression equation for phenolics contents had an excellent of fit. The optimized extraction temperature was 134 ℃,extracting time was 31 minutes,and solvent/solid ratio was 52∶1 mL/g. Under the optimized conditions,the total phenolics content was 169.24 mg GAE/g,which was consistent with the predictive value of 173.31 mg GAE/g. In addition,the total phenolic content of the optimized extracts was higher than the reflux extraction using aqueous-organic solvent,and the time was shortened.

pomegranate leaves;total phenolics;subcritical water extraction;response surface methodology

TS209

B

1002-0306(2017)19-0184-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.19.034

2017-04-14

闫林林(1986-)，女，博士，助理研究员，研究方向：植物资源提取分离与开发利用，E-mail：yanlinlin155@163.com。

*通讯作者:郑光耀(1964-)，男，本科，副研究员，研究方向：植物资源提取分离与开发利用，E-mail：zhguya@sina.com。

中国林业科学研究院林产化学工业研究所研究团队建设创新工程项目(LHSXKQ4)。