48例肺磨玻璃结节患者血浆中miR-10b的表达及意义

陈兴隆 董明

48例肺磨玻璃结节患者血浆中miR-10b的表达及意义

陈兴隆1董明2

目的探讨肺磨玻璃结节患者血浆中miR-10b作为诊断标记物的可能性。方法收集48例肺磨玻璃结节患者血浆，经术后病理证实良性病变16例，癌前病变(AAH，AIS)16例，微浸润性腺癌(MIA)8例，浸润性腺癌(IA)8例，采用实时荧光定量PCR检测各组血浆miRNA-10b水平，分析miRNA-10b与肺磨玻璃结节不同病理类型之间的关系。绘制ROC曲线，评估其诊断意义。结果肺癌相关组血浆miR-10b水平(RQ=0.828(0.485,1.700))较良性病变组(RQ=0.458(0.271,0.698))上调1.808倍，差异具有统计学意义(P=0.007)；血浆miR-10b RQ值为0.731时，诊断微浸润腺癌(MIA)的AUC为0.827，敏感性为100%，特异性为67.5%；RQ 值为 1.137时，诊断浸润性腺癌(IA)的AUC为0.853，敏感性为75%，特异性为87.5%。结论GGO结节患者肺癌相关病变血浆miR-10b显著上调，特别是对微浸润腺癌和浸润性腺癌有一定诊断意义，有望成为GGO结节诊断标记物。

microRNA-10b; 肺磨玻璃结节; 诊断标记物

肺癌是世界范围内死亡率最高的恶性肿瘤[1]，我国肺癌的发病率和死亡率也居高不下[2]。而随着计算机断层扫描(Computed tomography, CT)技术的不断发展，使早期筛查肺癌高危人群从而早诊早治，改善预后成为可能。基于美国国家肺癌筛查实验(National Lung Screening Trial, NLST)的结果[3]，2015年起，我国和美国开始在全国范围内普及推广低剂量CT(Low-Dose CT, LDCT)肺癌早期筛查项目[4-5]。随着筛查工作的展开，越来越多的肺磨玻璃结节(ground-glass opacity nodules, GGO-nodules)被检出。GGO结节CT表现为模糊的混浊致密影，局部呈云雾状表现，密度轻度增加，但仍可见血管及支气管结构，这类影像学改变是由细胞及肺泡壁组织液增多造成的，代表着肺泡及肺间质的变化[6]。根据近期世界卫生组织(World Health Organization，WHO)的分类[7]，GGO结节相关恶性病理表现包括：癌前病变(非典型腺瘤样增生Atypical adenomatous hyperplasia, AAH和原位腺癌Adenocarcinoma in situ, AIS)，微浸润腺癌(Minimally invasive adenocarcinoma, MIA)和浸润性腺癌(Invasive adenocarcinoma，IA)。目前认为腺癌遵循一种循序渐进的恶变方式，由AAH转变为AIS，最终转化为浸润性腺癌。除此之外，GGO结节还与肺感染，肺水肿，肺间质性疾病有关[8]。而正确判断GGO结节的良恶性并及时临床干预对于我国刚起步的LDCT筛查项目至关重。本文结合我国LDCT筛查项目的时代技术背景，研究分析48例GGO结节患者血浆miR-10b与其病理类型之间的联系，初步探讨miR-10b作为GGO结节诊断标记物的可能。

资料与方法

一、一般资料

2014年7月-2015年12月天津医科大学总医院收治肺磨玻璃结节患者48名，年龄37-69岁，平均58岁，男性15例，女性23例，术前未行任何针对肿瘤前期辅助治疗，包括放疗，化疗等，术后组织病理确诊为良性结节16例，癌前病变(非典型腺瘤样增生，原位腺癌)16例，微浸润腺癌8例和浸润性腺癌8例，受试者知情理解并签署知青同意。

二、标本采集及miRNA提取

用EDTA抗凝管完成外周血采集，采集量10mL，分别以1000×g离心15min，12000×g离心10min,分离提取上层血浆300 μL。按miRNA提取分离试剂盒操作提取miRNA，保存于-80℃冰箱。

三、实时荧光定量RT-PCR

按miRNA逆转录试剂盒说明合成cDNA，茎环状结构特异性逆转录引物序列(表1)，以miR-16为内参基因，合成cDNA保存于-30℃冰箱。按荧光定量试剂盒说明检测miR-10b的表达。2-ΔΔCt法分析结果。RQ=2-ΔΔCt。ΔCt=目标基因Ct-内参基因Ct，ΔΔCt=待测标本的ΔCt-对照本的ΔCt。

表1 miR-10b及内参miR-16引物序列

四、统计学处理

结 果

一、良性病变组与肺癌相关组(AAH, AIS, MIA, IA)水平比较

肺癌相关组血浆miR-10b水平(RQ=0.828(0.485,1.700))较良性病变组(RQ=0.458(0.271,0.698))上调1.808倍，差异具有统计学意义(P=0.007)(见图1)。

二、血浆miR-10b与GGO结节病理特征的关系

血浆MiR-10b水平肺良性病变与癌前病变相比无统计学意义(P>0.05)，癌前病变与微浸润腺癌及浸润性腺癌表达差异有统计学意义(P<0.05)，微浸润腺癌与浸润性腺癌表达的差异无统计学意义，P>0.05，(见表1)。

三、血浆miR-10b对肺磨玻璃结节的诊断效能

血浆miR-10b做为癌前病变(AHH，AIS)的诊断标记物，AUC为0.315，缺乏敏感性和特异性；血浆miR-10b RQ值为0.731时，诊断微浸润腺癌(MIA)的AUC为0.827，(95%CI：0.711-0.943)，敏感性为100%，特异性为67.5%；血浆miR-10b RQ 值为 1.137时，诊断浸润性腺癌(IA)的AUC为0.853，(95%CI：0.721-0.986)，敏感性为75%，特异性为87.5%(见图2)。

表1 血浆miR-10b与肺腺癌及癌前病变表达关系

图1 2组血浆miR-10b RQ 比较

图2(A)miR-10b作为癌前病变(AAH，AIS)诊断标记物ROC曲线, (B)miR-10b作为微浸润腺癌(MIA)诊断标记物ROC曲线, (C)miR-10b作为浸润性腺癌(IA)诊断标记物ROC曲线

讨 论

microRNA与肿瘤的发生发展密切相关[9]，而血浆中microRNA不易发生变性降解，性质稳定，易于检测，是作为诊断标记物的理想选择[10]。

miR-10b定位于homeobox protein(HOX)基因簇，其表达促进多种肿瘤的侵袭和转移[11-12]。本研究结果显示，对于筛查发现的GGO结节，肺癌相关组(癌前病变，微浸润腺癌，浸润性腺癌)血浆miR-10b水平明显高于良性病变组，特别是在微浸润腺癌，及浸润性腺癌组，表达水平明显增高。尽管miR-10b用于诊断癌前病变(AAH，MIA)缺乏敏感性和特异性，但其表达为0.731时，诊断微浸润腺癌(MIA)的AUC为0.832，(95%CI：0.723-0.941)，敏感性为100%，特异性为66.7%；表达为 1.137时，诊断浸润性腺癌(IA)的AUC为0.855，(95%CI：0.726-0.985)，敏感性为75%，特异性为87.5%。表明其对微浸润腺癌(MIA)和浸润性腺癌(IA)有着较为准确的诊断价值，较有创检查安全，依从性高。有望成为LDCT筛查项目中，GGO结节辅助诊断的指标。本研究作为前期探索性试验，选用的样本量及病历数较少，全部都是我国华北地区人群，单中心研究，缺乏地域差异，没有人种差别，但本研究为探讨miR-10b作为辅检GGO结节标记物的可能性打下了一定基础。在未来的研究中，我们将进一步加大样本量和病例数量，联合其他多种microRNA及肿瘤标志物，提高诊断特异性及敏感性。结合目前我国LDCT筛查项目的启动与发展，有望建立更加完善的GGO结节诊断处理原则，进一步加强LDCT筛查项目的效果，降低肺癌的死亡率，改善预后。

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ExpressionandsignificanceofplasmamiR-10bin48patientswithground-glassopacitynodules

CHENXing-long,DONGMing

TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China

ObjectiveTo investigate the possibility of the expression of miR-10b as the diagnostic marker in patients with ground-glass opacity nodules.MethodsThe expression of miR-10b was detected by real-time quantitative PCR in 48 patients with ground-glass opacity nodules. The relationship between miR-10b expression and clinical characteristics was analyzed. ROC was drawn to evaluate the diagnostic value of miR-10b to the diagnosis of lung adenocarcinoma.ResultsThe expression of plasma miR-10b of the lung relation group [RQ=0.828 (0.485, 1.700)] was 1.808 times the control group [RQ=0.458 (0.271, 0.698)] (P=0.007). while the expression of miR-10b was 0.731, the diagnosis MIA sensitivity was 100%, the specificity was 82.4% and AUC was 0.827. While the expression was 1.137, the diagnosis IA sensitivity was 75%, the specificity was 82.4% and AUC was 0.853.ConclusionThe plasma miR-10b level is up-regulated in patients with lung cancer related patients, which suggests miR-10b might be used as a potential tumor marker for the diagnosis of ground-glass opacity nodules.

microRNA-10b; lung ground-glass opacity nodules; diagnosis biomarker

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.010.032

国家自然科学基金(No 81600073);天津市卫生局科技基金(No 2014KZ127)

1. 300070 天津，天津医科大学 2. 300052 天津，天津医科大学总医院肺部肿瘤外科

董明，E-mail:tjydming@yeah.net

2017-01-25]