黄烷酮对映体的高效液相色谱手性拆分及含量测定

陈 程， 袁倩姝， 张静雨， 李晓旋， 王 勇

(天津大学理学院，天津 300350)

手性分子存在于所有生命体中，蛋白质、核酸、氨基酸、多糖等具有手性的分子构成了生命体本身[1]。手性分子在医药、食品、农药等众多行业中也扮演着重要的角色。大多数药物分子具有手性中心，其两个对映体在生命体中往往表现出不同的药代动力学和药效学特性，典型的例子是沙利度胺[2]。在食品工业中，大量的添加剂、调味剂、防腐剂，包括许多有机食品，都是手性化合物。农用化学品中的对映体对植物生长有影响，并且可能进一步对环境产生副作用，甚至对人体健康产生毒性影响[3]。因此，利用手性拆分获取对映体中的光学纯部分具有重要的现实意义。

黄烷酮(Flavanone)及其衍生物大量存在于天然产物中，并且表现出诸多生物活性，如杀菌、抗炎、抗肿瘤、抗诱变、抗氧化、抗HIV病毒、抗心血管疾病、抗恶性细胞增生作用等[4]，它是一类研究价值很高的化合物。黄烷酮母体上共有10个可被取代的位置，具备极大的结构修饰潜力[5]，而且黄烷酮是合成多种类黄酮类化合物的中间体。因此，获取光学纯黄烷酮对映体化合物具有十分重要的意义。

环糊精在制药、食品、农业、化妆品、卫生、纺织、环境、催化、生物技术及色谱等几乎所有的工业领域都有广泛的应用[6]。环糊精分子具有略呈锥形的中空圆筒立体环状结构，内部疏水而外部亲水[7]，同时具有多个手性中心，具有手性识别功能，特别是衍生化的β-环糊精键合固定相，对手性化合物具有良好的拆分能力，因此被大量应用于高效液相色谱法的手性拆分[8]。本实验选取环糊精手性色谱柱，利用高效液相色谱测定样品中R-及S-黄烷酮构型的含量，优化分离条件并确定旋光纯构型的保留顺序。目前，高效液相色谱法已广泛应用于手性化合物的拆分。但对于黄烷酮对映体的构型保留顺序的确定及对其在环糊精固定相手性分离的全面优化研究还未见报道。本研究为该类化合物的拆分提供方法参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LC-16高效液相色谱仪(日本，岛津公司)。

R-黄烷酮(纯度98%，天津希恩斯奥普德科技有限公司)；乙腈、甲醇(色谱纯)；待测黄烷酮样品，用高纯水溶解样品，样品浓度为0.5 mg/mL。实验用水为高纯水。

1.2 色谱条件

色谱柱：CD-CSP2手性柱；流动相：乙腈(ACN)-水、甲醇(MeOH)-水；流速为1.0 mL/min；检测波长为254 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。流动相使用前用滤膜过滤。

2 结果与分析

2.1 流动相中有机溶剂种类对分离效果的影响

流动相中有机溶剂种类对R、S-黄烷酮拆分效果有较大影响。实验分别以乙腈-水和甲醇-水为流动相(体积比均为50∶50)，在流速为1.00 mL/min、柱温为30 ℃的条件下，研究色谱柱在不同有机溶剂种类条件下手性拆分的性能。相关的色谱分离结果见图1。由图1可知，以甲醇-水为流动相时有机溶剂出峰较慢，分离度较差，而以乙腈-水为流动相时有机溶剂出峰较快，分离效果较好。这是由于反相高效液相色谱是以强疏水性的填料为固定相，流动相的极性越小洗脱能力越强。乙腈的极性比甲醇小，且乙腈是极性非质子性溶剂，故它的洗脱能力要比甲醇强。因此，使用乙腈-水为流动相进行后续实验。

2.2 流动相比例对分离效果的影响

流动相比例对R、S-黄烷酮拆分效果有较大影响。以乙腈-水为流动相，在流速为1.00 mL/min、柱温为30 ℃的条件下，考虑保留因子、选择性及分离度随流动相比例的变化，从而研究色谱柱在不同流动相比例条件下手性拆分性能。选择乙腈-水体积比30∶70至70∶30进行实验，不同比例下的色谱分离情况见图2，相关的色谱分离参数见表1。由表1可知，随流动相中乙腈的比例增加，保留因子、选择性及分离度不断减小。在流动相为乙腈-水=30∶70(体积比)的条件下，黄烷酮手性拆分效果最好。可能是随着流动相中乙腈比例的增加，乙腈占据了环糊精的空腔，降低了环糊精的手性拆分作用力，使得黄烷酮样品的保留时间减少，拆分效果降低。因此，使用体积比为30∶70的乙腈-水为流动相进行后续实验。

图1 流动相中有机溶剂种类对分离效果的影响Fig.1 The effect of species of mobile phase on the enantiomeric separation

图2 流动相比例对分离效果的影响Fig.2 The effect of composition of mobile phase on the enantiomeric separation 表1 流动相比例对分离效果的影响Table 1 The effect of composition of mobile phase on the enantiomeric separation

Composition of mobile phaseCapacity factork1k2Separation factor(α)Resolution(RS)30%1.732.581.522.9540%0.500.661.471.8650%0.440.581.320.9660%0.220.241.11<0.370%--10

2.3 流速对分离效果的影响

根据色谱动力学理论范氏方程可知，流速对色谱拆分行为会产生重要的影响。本实验研究不同流速下β-环糊精对黄烷酮手性拆分效果的影响，数据列于表2，不同流速下的色谱分离情况见图3。由表2可知，随着流速的增加保留时间缩短，选择性不变，分离度呈RS逐渐减小的趋势。这是由于随着流速的增加，导致溶质洗脱速度加快，但同时传质阻力项影响增大，导致保留因子变化波动。因此，在手性拆分中选择一个适宜的流速十分重要。由于流速为1.0 mL/min时，在较短的时间内获得较高的分离度，后续实验将固定流速为1.0 mL/min。

表2 流速对拆分行为的影响Table 2 The effect of flow rate on the enantiomeric separation

2.4 温度对分离效果的影响

在乙腈-水(30∶70，V/V)为流动相，流速为1.0 mL/min的条件下，测定不同温度对黄烷酮拆分效果的影响。因受室温限制，选择温度范围30 ℃至45 ℃进行探究。不同温度下的色谱分离情况见图4，数据列于表3。由表3可见，随着温度的升高，选择性、保留因子和分离度均有所下降。温度升高提高了溶质扩散，削弱了环糊精空腔及其他作用位点与样品之间的相互作用，导致样品被快速洗脱。因此，在一定范围内温度越低越有利于样品分离，选择30 ℃为最佳温度。由2.1、2.2和2.3的优化结果可知，黄烷酮在环糊精手性色谱柱上最佳分离条件为：流动相为乙腈-水(30∶70，V/V)、流速为1.0 mL/min、温度为30 ℃。

图3 流速对拆分行为的影响Fig.3 The effect of flow rate on the enantiomeric separation

图4 温度对拆分行为的影响Fig.4 The effect of column temperature on the enantiomeric separation 表3 温度对拆分行为的影响Table 3 The effect of column temperature on the enantiomeric separation

Column temperature(℃)Capacity factork1k2Separation factor(α)Resolution(RS)301.782.771.552.98351.542.271.472.51401.291.811.402.03451.101.481.341.64

图5 R-型黄烷酮和外消旋黄烷酮色谱图Fig.5 Charomatogram of R-flavanone and racemic flavanone

2.5 R、S-黄烷酮定性分析

在流动相为乙腈-水(30∶70，V/V)、流速为1.0 mL/min、温度为30 ℃的条件下，分别测得R-黄烷酮和外消旋黄烷酮的色谱图，如图5。根据保留时间可得到，外消旋黄烷酮的色谱图中，前者为R-黄烷酮峰，后者为S-黄烷酮峰。

2.6 R、S-黄烷酮定量分析

在流动相为乙腈-水(30∶70，V/V)、流速为1.0 mL/min、温度为30 ℃的条件下，分别求出样品中所有组分的峰面积Ai和相对校正因子fi，然后依次求出各组分的质量分数wi，使用归一化法进行定量分析,经计算可知黄烷酮样品中，R-黄烷酮含量为53.94%，S-黄烷酮含量为46.06%。

3 结论

高效液相色谱手性拆分黄烷酮对映体，并对其进行定性、定量分析，综合考虑分析时间和分离效果，确定黄烷酮对映体的最佳分离条件为流动相为：乙腈∶水=30∶70(体积比)、流速为1.0 mL/min、温度30 ℃。R-黄烷酮与固定相的作用弱于S-黄烷酮，在色谱柱中首先被洗脱。以面积归一化法计算，可知黄烷酮样品中R-黄烷酮含量为53.94%，S-黄烷酮含量为46.06%。