菌株发酵特性研究及复合酸奶发酵剂的筛选

苏敦，任发政，刘松玲，马雨璇，高增丽，李周勇，杨子彪，母智深

(1.内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司，呼和浩特 011500；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京市高等学校畜产品工程研究中心，北京 100083；3.大理农林职业技术学院，大理 671003)

乳与乳制品

菌株发酵特性研究及复合酸奶发酵剂的筛选

苏敦1,2，任发政2，刘松玲2，马雨璇2，高增丽1，李周勇1，杨子彪3，母智深1

(1.内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司，呼和浩特 011500；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京市高等学校畜产品工程研究中心，北京 100083；3.大理农林职业技术学院，大理 671003)

为探究具有良好性能的酸奶复合发酵剂配方，用不同发酵特性的2株嗜热链球菌、1株保加利亚乳杆菌和1株嗜酸乳杆菌，测定其单菌株的发酵性能及贮藏稳定性，并通过单菌和复配菌发酵乳的感官分析，得到了6组优化的含4株菌的发酵剂配方。然后，对这6组配方的酸奶进行贮藏期间滴定酸度、活菌数、乙醛和双乙酰含量的测定，评价菌株不同复配比例对酸奶贮藏期口感和风味的影响，从而得出一组最佳发酵剂菌株比例为C1-2：C8：CM5：LB3=107：1/5×107：1/5×107：102。

乳酸菌；酸奶；复合发酵剂；发酵特性；感官分析

酸奶是以生乳或奶粉为原料，经杀菌后利用乳酸菌发酵使pH值降低，形成的凝固或不凝固（等电沉淀）状态的乳制品[1]。酸奶不仅保留了原奶的全部营养，在发酵过程中，乳酸菌还利用乳中的碳源、氮源、矿物质及生长因子等物质，产生人体更易消化和吸收的单糖、短肽、氨基酸、短链脂肪酸及多种维生素等人体所需的多种营养素，对健康起到有益作用[2,3]。自1907年俄罗斯生物学家、诺贝尔奖获得者Elie Metchnikoff提出“酸奶长寿说”，酸奶促进人体健康的机制逐渐被人们所揭示，酸奶及发酵乳饮料产业在世界范围内得到迅速发展。具有独特风味和良好口感的发酵乳不仅为消费者所钟爱，也是科学研究的热点。这对菌种的选择、菌株的优化搭配和发酵剂的制备提出了更高的要求。

酸奶发酵剂是由嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌以及其他辅助菌株共同组成的，这些菌株以不同比例共生在同一个微生态环境体系中，反复着互相促进和拮抗的关系，形成了酸奶的微生物菌群[4,5]。乳酸菌发酵剂的重要特性包括迅速产酸、产黏和产香等特性，并形成稳定平衡的感官品质。然而，单一菌株是难以具备产酸快、产黏高、抗噬菌体、产香好等综合特性。因此，将不同发酵特性的优良菌株进行组合有利于提升发酵剂的整体性能，也是生产优质酸奶和发酵乳饮料的关键环节。

本试验利用分离自内蒙古传统酸奶的1株产酸快、1株产黏高的2株嗜热链球菌，1株保加利亚乳杆菌和1株嗜酸乳杆菌，测定其单菌的发酵性能及贮藏稳定性，并对菌株进行不同比例的混合发酵，通过感官评价选定代表性组合测定贮藏期的滴定酸度、活菌数、乙醛和双乙酰等指标，分析不同组合菌对酸奶口感和风味的影响，确定最佳复配比例，为筛选优良酸奶复合发酵剂提供基础数据。

1 材料与方法

1．1 材料

1.1.1 菌株

本研究所用菌株均分离自内蒙古传统酸奶，保藏于内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司研发中心乳酸菌菌种资源库，分别是Streptococcus thermophilus C1-2、Streptococcus thermophilus C8、Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus LB3和Lactobacillus acidophilus CM5 4株菌株。

1.1.2 试剂

MRS液体培养基；MRS固体培养基（MRS液体培养基添加1.5%的琼脂粉）；M17液体培养基；M17固体培养基（M17液体培养基添加1.5%的琼脂粉）；纯牛奶，购自内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司；灭菌生理盐水及0.1mol/L NaOH。

1.1.3 设备

电热恒温培养箱、紫外分光光度计、流变仪、pH计等。

1．2 方法

1.2.1 菌株活化

将冷冻保存的乳酸菌按2%的接种量接种至液体培养基里传3代进行活化，杆菌用MRS液体培养基，球菌用M17液体培养基。将第3代的菌培养液经4 500r/min离心10min后弃上清，接种到牛乳培养基。

1.2.2 发酵乳样品的制备

纯牛奶添加7%的白砂糖，经90℃杀菌5min后迅速冷却至43℃，将供试单菌株按107CFU/g的量接种到牛乳中进行发酵。发酵期间每隔1h测一次pH和活菌数，共测6次。贮藏期间（至发酵终点pH达4.3之后4℃贮藏）在0h、1d、2d、3d、5d、10d、15d和20d分别测定酸度、黏度和活菌数。每个样品测3个平行。

1.2.3 pH值的测定

待乳样温度为常温时，用pH计测定其pH值。

1.2.4 滴定酸度（oT）的测定

称取5g乳样于锥形瓶中，加入20mL蒸馏水，再加入两滴0.5%酚酞指示剂，摇匀，用0.1mol/L的NaOH溶液滴定至微红色，静置30s不褪色，记消耗NaOH溶液的体积（mL）。酸度计算公式为：

式中：X为发酵乳样品的滴定酸度(°T)；c为NaOH标准溶液的浓度(mol/L)；V为滴定时消耗NaOH标准溶液体积(mL)；m为发酵乳样品的质量(g)；0.1为酸度理论定义NaOH溶液的浓度(mol/L)。

1.2.5 活菌数的测定

取1mL乳样加到9mL生理盐水中进行梯度稀释，然后取1mL加到培养皿中与固体培养基混合，球菌用M17琼脂，杆菌用MRS琼脂，于43℃恒温培养箱中培养48h后计其活菌数。

1.2.6 黏度的测定

采用旋转流变仪，样品量15mL，转子60mm steel plate，在温度4℃、剪切频率0～200 1/s、时间间隔为10s条件下，连续测量60个数据点，测定时间为10min。

1.2.7 感官评价

至发酵终点pH到4.3后，取出低温贮藏24h的样品进行感官评价。将各酸奶样品20mL分别装于一次性品尝杯中，对样品的风味形成度、酸风味、甜风味、浓厚度、光滑度、黏弹性、酸味、甜味指标进行综合打分，各项指标满分为10分。不喜欢打1～3分，一般打4～6分，较喜欢打7～9分，非常喜欢打10，总分为80分。由受过专业训练的8位品评员参加品评，他们完全理解感官特性，熟知酸奶的评价标准。感官评价指标和相应的标准见表1。

表1 感官评价指标及标准

1.2.8 乙醛的测定

将8%的三氯乙酸（TCA）溶液与样品1∶1混合，振荡摇匀，以4 500r/min离心10min（4℃），上清经滤纸过滤后取5mL，加入1.00mL NaHSO3溶液摇匀，室温下放置1h，反应完成后加入0.5mL 1%淀粉溶液，滴入0.1mol/L碘液，接近终点时换0.01mol/L碘液，至溶液恰好为淡蓝色且30s不褪色，即为初滴定终点，不计数。然后加10mL1mol/L NaHCO3，振荡使溶液蓝色消失，最后用0.01mol/L碘标准溶液滴定至恰好呈蓝色且30s不褪色，记录消耗标准碘液的体积，同时做空白样。

1.2.9 双乙酰的测定

双乙酰标准曲线的绘制：配制双乙酰标准溶液，浓度为0.0、3.0、6.0、9.0、12.0、15.0μg/mL。将各浓度标准液与等体积8%三氯乙酸溶液混匀，并取混合液10mL，加入0.5mL1%邻苯二胺溶液，空白组不加，摇匀后置于黑暗处放置30min。待反应完全后，标准溶液中加入2mL 4.0mol/L盐酸，空白中加入2.5mL 4.0mol/L盐酸，终止反应。混匀后以空白组作为参比液，在335nm波长下测定吸光度值。以双乙酰浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。

样品中双乙酰浓度的测定：将8%的三氯乙酸溶液与样品1∶1混合，振荡摇匀，4 500r/min离心10min（4℃），将上清用滤纸过滤后取10mL，加入0.5mL 1%邻苯二胺溶液，摇匀后置于黑暗处放置30min。待反应完全后，标准溶液中加入2mL 4.0mol/L盐酸终止反应。以纯牛奶作为对照，在335nm波长下测定吸光度值，然后根据双乙酰标准曲线获得待测样品中双乙酰浓度（mg/L）。

2 结果与分析

2．1 单菌株的发酵性能

2.1.1 单菌发酵过程中pH值的变化

图1显示了4株乳酸菌在6h发酵过程中pH值的变化。从图中可以看出，随着发酵时间pH值逐渐下降，菌株C8在乳中的产酸速度为最快，发酵6h的pH能达到4.31，而CM5株为最慢，pH为5.19，其他两株C1-2和LB3的pH分别是4.82和4.91。

乳酸菌的产酸速率及发酵特性是筛选发酵剂菌种的重要因素。然而，酸奶的工业化生产终产品的pH值控制范围为4.2～4.3，酸度为80～120oT，发酵时间一般为4～7h。产酸快、产酸量大，发酵时间短是筛选优良发酵剂菌种的首要条件。本试验使用的嗜热链球菌C8株的单菌产酸速率能达到商业发酵剂的标准，然而嗜热链球菌也是酸奶发酵剂的主要产酸菌种，因此C8株对开发酸奶发酵剂有很好的潜力。

图1 4株菌在6h发酵过程中pH的变化

2.1.2 单菌发酵过程中活菌数的变化

乳酸菌活菌数是酸奶产品的一个重要指标，它不仅影响酸奶发酵过程中的风味形成，还对促进人体营养与健康有着重要的作用。从图2中可以看出，培养6h菌株C8和LB3的活菌数达到8.86log10CFU/mL和8.16log10CFU/mL，相比初始的7.86log10CFU/mL和7.09log10CFU/mL增长了10倍，而其他2株菌的活菌数增长速度相对较慢，这个结果跟菌株的产酸能力成正比。

图2 4株菌在6h发酵过程中活菌数的变化

2．2 单菌发酵乳的贮藏稳定性

2.2.1 贮藏期间滴定酸度的变化

图3中表示4株乳酸菌的贮藏期滴定酸度的变化。如图可知，2株嗜热链球菌C8和C1-2在贮藏第20天的滴定酸度为83.30oT、86.34oT，跟发酵终点的80.77oT和83.32oT相比几乎没有太大的变化，只增加了3oT左右。嗜酸乳杆菌CM5株的变化范围为72.67～86.84oT，变化幅度是14.17oT，出现可接受的少量后酸化现象。然而保加利亚乳杆菌LB3株在贮藏的20d内从发酵终点的75.63oT增到120.65oT，增加的幅度为45.02oT。保加利亚乳杆菌的后酸化现象比较严重，有文献报道引起酸奶后酸的主要原因是保加利亚乳杆菌的后酸化[6]，保加利亚乳杆菌具有很强的耐酸性和产酸能力，贮藏期间能继续生长代谢乳糖产酸并导致酸奶发生后酸化现象[7,8]。

图3 单菌贮藏期间滴定酸度的变化

2.2.2 贮藏期间黏度的变化

由图4的结果可以得出4株乳酸菌中发酵终点产黏最高的是嗜热链球菌C1-2，黏度为1.98mPa/mm，贮藏第20天的黏度为1.97mPa/mm，贮藏期间没有明显变化。而菌株C8在贮藏期间黏度从0.96mPa/mm增到1.19mPa/mm，主要增黏时间是贮藏第1～3天。其他2株菌的黏度也没有明显的变化。C1-2是一株产胞外多糖的菌，发酵1h就开始会出现拉丝现象。乳酸菌分泌的胞外多糖能够赋予酸奶细腻爽滑的口感，在低浓度下就具有增稠作用，并能改善产品的流变和质构特性[9～12]。

图4 单菌储藏期间黏度的变化

2.2.3 贮藏期间活菌数的变化

菌株C8、LB3和CM5的贮藏期间活菌数从8.93 log10CFU/mL、8.97log10CFU/mL、8.39log10CFU/mL降至7.92log10CFU/mL、7.98log10CFU/mL、5.44log10CFU/mL，其中CM5的下降幅度最大，为2.95log10CFU/mL。然而菌株LB3一度出现活菌数增加趋势，这也是保加利亚乳杆菌引起后酸化的原因。另外，菌株C1-2贮藏第20天的活菌数为7.2log10CFU/mL，相比发酵终点的7.50log10CFU/mL几乎没有显著变化（图5），这可能是因为C1-2产生的胞外多糖对菌体有一定的保护作用。

图5 单菌贮藏期间活菌数的变化

2．3 发酵乳样品的感官评价

2.3.1 单菌发酵乳的感官评价

单菌发酵乳的感官评价中C1-2株的风味和口感为最受欢迎，评价指标中的浓厚度、润滑度和黏弹性都显著高于其他菌株（图6）。其次是菌株C8的酸奶有较好的风味和浓厚度，评价总分为51.59。菌株CM5的酸奶有一股苹果酸的风味。另外，LB3株的发酵乳具有较大的苦味，这可能跟保加利亚乳杆菌的蛋白水解产物肽类和氨基酸等物质有关。

图6 单菌发酵乳的感官评分

2.3.2 两株菌复合发酵乳的感官评价

本研究的目的是开发一种有较好的产黏性能、产酸快、产香好的酸奶发酵剂，然而菌株C1-2具有较高的产黏及较好的感官特性，C8株能快速产酸，因此以C1-2株为标杆菌复配C8株，确定两株嗜热链球菌的最佳配比后再进行其他两菌株的复配。

对最佳复配比例的确定，本试验结合了发酵时间和感官评分的结果。从表2中可以看出，感官评价总分最高的是第8组，其次是第3组，但由于第8组的产酸速率比较慢，到达发酵终点的所用时间为9.5h，而第3组的发酵时间为7.5h，结合感官评分的结果选定第3组为两株嗜热链球菌的最佳组合，C1-2株和C8株的接种比例为107∶1/5×107。

表2 两株嗜热链球菌复合发酵乳的感官评分

2.3.3 三株菌复合发酵乳的感官评价

在两株嗜热链球菌最佳比例基础上复配第三株菌，分别使用保加利亚乳杆菌LB3（表3）和嗜酸乳杆菌CM5（表4）。添加LB3株的8组复配中发酵终点的时间范围为3.75～12h，感官评分44.38～60.62。其中，第3组的发酵时间为6h，感官评分最高为60.62，因此选定本组为最佳组合，三株菌C1-2∶C8∶LB3的比例为107∶1/5×107∶1/5×107。复配CM5株的8个组合中发酵终点时间最短（7h）、感官评分最高（59.00）的也是第三组，菌株C1-2∶C8∶CM5的比例是107∶1/5×107∶1/5×107，选定本组为最佳复配组合。

表3 两株嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌LB3复合发酵乳的感官评分

表4 两株嗜热链球菌与嗜酸乳杆菌CM5复合发酵乳的感官评分

2.3.4 四株菌复合发酵乳的感官评价

选定的两组三株菌组合的基础上复配第四株菌，结果见表5和表6。由于感官评价得分相差不是很大，本研究从4株菌的复配中选择较好的6个组合后续进行了贮藏稳定性评价试验。三株菌复配嗜酸乳杆菌CM5株的8个组合达到发酵终点的时间范围为6.25～10h，感官评价得分为56.67～66.67，其中第1、2、4组的感官评分较高，发酵时间较短，因此选择这三组为优选组合。三株菌复配保加利亚乳杆菌LB3株的8个组合的发酵终点时间为6.5～7.75h，感官评价得分为55.22～64.78，由于发酵时间比较接近，根据感官评分选定第1、3、8组为优选组合。

表5 三株菌与嗜酸乳杆菌CM5复合发酵乳的感官评分

表6 三株菌与保加利亚乳杆菌LB3复合发酵乳的感官评分

2．4 优选复配组合发酵乳的贮藏稳定性

2.4.1 优选复配组合发酵乳贮藏期间滴定酸度的变化

四株菌优选复配组合的菌株比例如表7所示。贮藏期间酸奶样品的滴定酸度变化见图7，随着贮藏时间的延长，滴定酸度在贮藏3d内快速增长，3d以后增长速度呈缓慢，贮藏20d内的酸度增长幅度范围在6.14～23.33°T。其中第2组的后酸化程度最低，变化幅度仅6.14°T，在本组中保加利亚乳杆菌的接种量最少，仅为102CFU/mL。结合前文试验结果，单菌发酵乳贮藏过程中保加利亚乳杆菌的后酸化现象最为严重，因此可以得出降低保加利亚乳杆菌的接种比例也能在一定程度上控制后酸化现象。有学者指出，能被消费者所接受的最大酸度值为120°T，高于120°T时酸奶风味及口感会发生变质[13]，然而本试验中各组发酵乳的滴定酸度均≤100.61°T，因此不会产生不愉快的口感。

表7 四株菌的复配比例

图7 四株菌不同复配组合发酵乳在贮藏期间滴定酸度的变化

2.4.2 优选复配组合发酵乳在储藏期间活菌数的变化

四株菌混合发酵乳在贮藏期间总球菌数和总杆菌数如表8所示。在整个贮藏期间嗜热链球菌的总菌数保持了108CFU/mL的数量级。杆菌中第2组的活菌数从发酵终点107CFU/mL的数量级降至103CFU/mL，其他组也呈不同程度的降值，但最多降了一个数量级。然而，第2组的菌株比例中嗜酸乳杆菌CM5的接种量为1/5×107CFU/mL、保加利亚乳杆菌LB3的接种量为102CFU/mL，根据CM5株在单菌贮藏期间活菌数下降的范围值，本组中总杆菌数贮藏20d降到103CFU/mL跟单菌的结果相符。这是因为嗜酸乳杆菌在贮藏期间活菌数降的快，使后酸化得到了控制，因此选择发酵剂所用杆菌时，用发酵性能相近而后酸化较弱的菌株来部分替代保加利亚乳杆菌也能控制酸奶的后酸化现象。

表8 4株菌的不同复配组合在贮藏过程中活菌数的变化 单位：log10CFU/mL

2.4.3 优选复配组合发酵乳在贮藏期间乙醛含量的变化

乙醛是酸奶中最具有代表性的芳香物质，其含量对酸奶风味具有重要影响。本研究中6组优选复配组合发酵乳的贮藏期乙醛含量变化各有不同（表9）。其中，第1组的乙醛含量从发酵终点的8.88μg/mL降至贮藏20d的0.74μg/mL，第2组中发酵终点的11.5μg/mL保持至贮藏3d的11.8μg/mL值，之后慢慢降到20d的2.22μg/mL。然而第3、4和5组中显示相同的变化趋势，分别从发酵终点的7.99μg/mL、7.85μg/mL、2.51μg/mL升高到贮藏3d的11.2μg/mL、12.5μg/mL和11.7μg/mL，3d后缓慢下降至20d的最低值，第6组的乙醛含量呈重复上升下降的现象。所有酸奶样中发酵终点的乙醛含量最高的是第2组，贮藏期间乙醛含量上升至最高的是第4组。在贮藏期乙醛含量下降是因为它具有挥发性，当贮藏条件不当时会有损失。

2.4.4 优选复配组合发酵乳在储藏期间双乙酰含量的变化

由表10可以看出，随着贮藏时间的延长，第1和2组的双乙酰含量呈逐渐下降趋势，第3和4组中的双乙酰含量在贮藏前期升高贮藏后期下降，而第5和6组中出现双乙酰含量的先下降再升高又下降的现象，其中从发酵终点到贮藏期终点双乙酰含量最高的为第2组，分别是20.8μ g/mL和14.0 μ g/mL，本组具有很好的产香特性。双乙酰是酸奶重要的产香物质，能赋予酸奶良好的奶油香味，即使存在极微量也会使酸奶风味得到很大的提高[14]。

根据贮藏期滴定酸度、活菌数、乙醛和双乙酰的变化情况，综合评价6组优选复配组合，本研究选定第2组为最好的发酵剂组合，其4株菌C1-2∶C8∶CM5∶LB3的复配比例为107∶1/5×107∶ 1/5×107∶102。

表9 四株菌优选复配组合发酵酸奶在贮藏期间乙醛含量的变化 单位：μg/mL

表10 四株菌优选复配组合发酵酸奶在贮藏期间双乙酰含量的变化 单位：μg/mL

3 结论

乳酸菌单菌株的发酵特性及复配比例可直接影响发酵剂性能及酸奶的感官特性。本研究使用的4株乳酸菌中嗜热链球菌C1-2的产黏和感官评分最高、嗜热链球菌C8产酸最快，然而保加利亚乳杆菌LB3的后酸化现象比较严重。在两株嗜热链球菌的复配中随着产酸快的菌株比例减少，酸奶发酵终点时间会延长，结合感官分析，综合评价结果显示：两株嗜热链球菌C1-2与C8的最佳配比为5∶1。随后依次复配两株杆菌，通过感官分析筛选出了6组优化的4株菌复合发酵剂配方。其中，有一组在贮藏稳定性试验中后酸化最弱、乙醛和双乙酰含量最高，本组的菌株复配比例为C1-2∶C8∶CM5∶LB3=107∶1/5×107∶1/5×107∶102，这也是最佳发酵剂组合。

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Abstract:The aim of this study was to develop a kind of good performance of the multi-strains yogurt starter.Two strains of Streptococcus thermophilus,Lactobacillus bulgaricus and Lactobacillus acidophilus were used to investigate the fermentation characteristics and storage stability in single culture and through the sensory analysis of fermented milk by single and co-culture, the 6 groups of optimized starter formula containing 4 strains were obtained. Then, the titratable acidity,viable count,acetaldehyde and diacetyl content of yogurt fermented by these 6 groups starter were mensurated and the effects of different proportion of strains on taste and fl avor of yogurt during storage period were evaluated. The result showed that the ideal strain proportion of starter was C1-2:C8:CM5:LB3=107:1/5×107:1/5×107:102.

Key words:Lactic acid bacteria; Yogurt; Starter; Fermentation characteristics; Sensory analysis

Study of Bacterial Strains Fermentation Characteristics and Development of Yoghurt Starter

SU Dun1,2, REN Fa-zheng2, LIU Song-ling2, MA Yu-xuan2, GAO Zeng-li1, LI Zhou-yong1,YANG Zi-biao3,MU Zhi-shen1
( 1.Inner Mongolia Meng Niu Dairy (Group) Co., Ltd, Hohhot 011500; 2.College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing Higher Instititution Engineering Research Center of Animal Product, Beijing 100083; 3.Dali Vocational and Technical College of Agriculture and Forestry, Dali 671000)

TS252.1

A

1004-4264（2017）09-0050-07

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.09.014