原花青素抑制小胶质细胞活化缓解阿片药诱导的痛觉过敏

张 艳 盛安琪 刘文涛 胡 亮 陶学有 张广钦

原花青素抑制小胶质细胞活化缓解阿片药诱导的痛觉过敏

张 艳 盛安琪 刘文涛 胡 亮 陶学有 张广钦

目的 探讨原花青素(PC)对小胶质细胞活化和阿片药诱导的痛觉过敏(OIH)的影响及其分子机制。方法 采用甩尾法检测OIH小鼠甩尾痛阈；免疫荧光法和Western blot法检测小鼠脊髓水平小胶质细胞标记分子(Iba1)表达水平。结果 将小鼠分为吗啡组、吗啡加PC给药组(20、 40、 80 mg/kg)和对照组(给予等体积生理盐水)。实验结果表明, 小鼠OIH造模后, 基础阈值由(9.35±0.48)s降至(5.47±0.39)s, 而对照组没有明显改变, 表示模型建立成功。提前15 min PC灌胃给药能够改善吗啡引起的OIH。40 mg/kg给药组灌胃给药2 d后小鼠热痛阈值与模型组相比, 差异具有统计学意义(P<0.05), 第2~5天改善效率分别为22.13 %、46.05%、33.50%、28.19%、44.70%。20、80 mg/kg给药组也有一定程度改善作用,但效果不如40 mg/kg给药组。采用免疫荧光技术和Western blot检测小鼠脊髓中小胶质细胞标记物Iba1的活化情况。免疫荧光结果表明, 与对照组相比, 模型组小鼠脊髓中Iba1明显激活, 而PC(40 mg/kg)可以显著抑制OIH小鼠脊髓中的Iba1的表达水平。Western blot法检测Iba1得到结果相似。结论 PC可以通过抑制小胶质细胞活化缓解OIH。

原花青素；阿片药诱导的痛觉过敏；神经炎症；小胶质细胞

吗啡是临床上常用的阿片类镇痛药物, 用于癌痛等顽固性疼痛的治疗。但是, 短期大剂量应用或者长期应用会导致机体对伤害性刺激的敏感性增高, 这种由阿片类药物导致的痛觉敏感性增加称为阿片药诱导的痛觉过敏(opioid-induced hyperalgesia, OIH), 严重限制了阿片类药物的使用［1-3］。目前,关于OIH的产生机制未完全阐明, 主要集中在中枢谷氨酸能系统活性增强、脊髓下行易化作用、内源性神经肽的作用等。而近期研究逐步开始聚焦脊髓胶质细胞, 尤其是小胶质细胞。小胶质细胞激活介导的神经炎症在疼痛中至关重要［4-7］。研究指出, 吗啡激活小胶质细胞中NOD 样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体, 促使炎症因子(如白介素-1β、肿瘤坏死因子-α等)大量释放, 这些炎症因子作为中枢免疫信号介导吗啡诱导的持续性痛觉敏化作用, 从而增加对伤害性刺激的敏感性［8-12］。原花青素(procyanidins, PC)是葡萄籽、蓝莓、樱桃等植物中广泛存在的一种生物类黄酮, 具有抗氧化、抗炎、改善肥胖等作用。近期有研究发现, PC可以通过抑制巨噬细胞活化从而改善急性痛风性关节炎［3］。但其对于OIH的作用未见报道。本文拟用不同剂量的PC, 研究其对小胶质细胞的活化和对OIH的影响并简要探讨其分子机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 药物 PC(南京泽朗医药植提技术有限公司)；吗啡(沈阳第一制药厂)。

1.2 动物 30只健康雄性ICR小鼠, 体重18~22 g, 由江苏省南京青龙山动物繁殖场提供, 实验动物许可证号：SYXK(苏 )2016-0011。

1.3 仪器 荧光显微镜(Zeiss AX10)；电泳仪(Bio-Rad)；化学发光仪(ChemiDoc XRS+)。

1.4 方法

1.4.1 OIH模型小鼠的制备及行为学测定 皮下注射10 mg/kg吗啡, 连续注射5 d, 2次/d 。以造模前1 d测得的小鼠热痛阈值作为基础痛阈。测量3次, 间隔10 min, 取平均值。以造模后热痛阈值较基础痛阈下降>20%者视为OIH模型成功。具体方法如下：将小鼠尾1.5~3.0 cm浸入恒温水浴中(47±0.5)℃, 用秒表记录鼠尾自浸入水中到出现甩尾动作的时间, 为防止组织损伤, 若小鼠10 s未甩尾, 则记为10 s。

1.4.2 Western blot法检测Iba1蛋白水平的表达 于第5天给药后取小鼠脊髓L4~6节段；按一定比例加入裂解液, 处理样品, 经聚丙烯酰胺凝胶电泳, 转移至PDVF膜上, 10%脱脂奶粉室温封闭1.5 h, 加入一抗过夜, TBST洗后二抗孵育2 h,TBST洗后显色。

1.4.3 免疫荧光检测脊髓背角Iba1表达 于第5天给药后0.5 h, 水合氯醛深麻下打开胸腔, 经左心室插管依次灌注生理盐水30 ml、4%多聚甲醛30 ml。取小鼠脊髓腰膨大部位经4%多聚甲醛固定、40%蔗糖溶液脱水后, 进行连续恒冷冰冻切片。将切片加入一抗过夜, 磷酸缓冲液(PBS)洗后加入荧光二抗孵育2 h, PBS洗后用50%甘油封片, 在荧光显微镜下观察。

1.5 统计学方法 采用GraphPad Prism6软件数据处理。计量资料以均数±标准差s)表示, 采用t检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 OIH小鼠热痛阈值的变化 水浴甩尾法测定小鼠热痛阈值。小鼠分为五组, 吗啡组、吗啡加PC给药组(20、40、80 mg/kg)和对照组(给予等体积生理盐水)。实验结果表明,小鼠OIH造模后, 基础阈值由(9.35±0.48)s降至(5.47±0.39)s,而对照组没有明显改变, 表示模型建立成功。提前15 min PC灌胃给药能够改善吗啡引起的OIH。40 mg/kg给药组灌胃给药2 d后小鼠热痛阈值与模型组相比, 差异具有统计学意义 (P＜0.05) , 第2~5天改善效率分别为22.13%、46.05%、33.50%、28.19%、44.70%。20、80 mg/kg给药组也有一定程度改善作用, 但效果不如40 mg/kg给药组。见图1。

2.2 PC对OIH小鼠脊髓小胶质细胞活化的影响 采用免疫荧光技术和Western blot检测小鼠脊髓中小胶质细胞标记物Iba1的活化情况。免疫荧光结果表明, 与对照组相比, 模型组小鼠脊髓中Iba1明显激活, 而PC(40 mg/kg)可以显著抑制OIH小鼠脊髓中的Iba1的表达水平。见图2。Western blot法检测Iba1也得到相似结果。见图3。

图1 连续PC灌胃给药对小鼠热痛阈值的影响

图2 免疫荧光法检测PC对小鼠脊髓背角Iba1的影响

图3 Western blot法检测PC对小鼠脊髓背角Iba1的影响

3 讨论

现有的改善OIH的药物主要有N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂、环氧化酶-2抑制剂、钙离子通道阻滞剂、α2受体阻断剂等［13-17］。但这些都不能彻底改善OIH,并且具有一定的副作用, 给患者带来沉重的经济负担和心理压力［18］。而本实验中使用的PC最高剂量为80 mg/kg, 等效人体剂量仅6.66 mg/kg, 抗炎效果佳, 安全性好, 无疑具有巨大的临床应用前景。

研究发现炎症因素在吗啡耐受中发挥着至关重要的作用［19］。吗啡激活神经突触后膜受体, 同时可以结合到小胶质细胞表面toll样受体4的MD-2亚基, 激活小胶质细胞, 进而释放大量促炎因子, 如炎症因子白介素-1β、白介素-6、肿瘤坏死因子-α［20-22］。这些炎症因子一方面激活邻近的胶质细胞, 诱发胞膜表面更多嘌呤能P2X4、P2X7受体、toll样受体4等表达增加；另一方面激活邻近的神经元上相应受体, 进一步促进NMDA受体的激活, 促进钙离子内流, 导致神经元异常性兴奋, 拮抗吗啡的镇痛作用［23］。实验室前期工作已经发现, PC可以通过抑制小胶质细胞激活来改善吗啡耐受［24］, 但是PC对于OIH的影响尚未报道。本实验研究发现, PC能抑制吗啡引起的脊髓背角小胶质细胞的活化, 显著改善阿片药物导致的OIH。Weng 等［25］应用半胱天冬酶抑制剂可以通过抑制小胶质细胞活化来改善吗啡耐受以及OIH症状。本文研究与上述研究结果一致。此外, PC可以通过抑制p38 MAPK缓解脂多糖诱导的炎症反应, 而p38 MAPK是主要表达在小胶质细胞中的MAPK家族成员。

综上所述, PC可能通过抑制小胶质细胞活化, 减轻神经炎症反应, 从而改善吗啡导致的OIH。目前, PC主要功效是抗氧化、抗过敏等。本实验发现PC可以抑制小鼠OIH的产生, 并对其可能的机制, 即抑制小胶质细胞活化进行了考察。研究成果为将来临床上应用PC治疗OIH提供理论依据, 并为阿片类镇痛药物的安全应用提供新的思路。

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10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2017.19.110

2017-08-17］

江苏省基础研究计划(自然科学基金)(项目编号：BK20161033)

211198 中国药科大学/临床药学教研室(张艳 盛安琪 张广钦)；南京医科大学/江苏省神经退行性疾病重点实验室(胡亮 陶学有)

张广钦