血红素加氧酶-1在高氧肺损伤小鼠中的表达及作用*

罗喜钢，王 毅，张凤香

(1.锦州医科大学附属第三医院检验中心，辽宁锦州 121001；2.锦州医科大学附属第一医院胸外科，辽宁锦州 121001)

论著·基础研究

血红素加氧酶-1在高氧肺损伤小鼠中的表达及作用*

罗喜钢1，王 毅1，张凤香2△

(1.锦州医科大学附属第三医院检验中心，辽宁锦州 121001；2.锦州医科大学附属第一医院胸外科，辽宁锦州 121001)

目的探讨血红素加氧酶-1(HO-1)在高氧造成的肺损伤转基因小鼠和正常小鼠中的肺部表达水平及其作用。方法把32只新生小鼠分成4组：野生型组(WT组)，特异性转基因小鼠全身高水平表达HO-1组[HO-1-FL(H)组，细胞质]、特异性转基因小鼠全身低水平表达HO-1组[HO-1-FL(L)组，细胞质]和切去C末端HO-1(Nuc-HO-1-TR组，细胞核)。把4组小鼠暴露在高氧环境中3 d，然后放到正常空气环境中，通过免疫组织化学、免疫荧光等实验技术来观察小鼠3 d、7 d和14 d肺泡发育情况及HO-1在小鼠肺部表达情况。结果HO-1在HO-1-FL(H)组小鼠肺部高表达，高氧暴露3 d后4组小鼠肺部肺泡发育都受到了损害，在正常空气环境中7、14 d时HO-1-FL(H)组小鼠的肺泡发育恢复得最好。结论小鼠肺部适度高水平的HO-1表达有助于高氧环境造成的小鼠肺损伤的恢复。

肺损伤；血红素加氧酶-1；基因敲除小鼠

血红素加氧酶-1(HO-1)是内质网的锚定蛋白[1]，在新生儿肺中含量丰富，但不响应于高氧的诱导[2-3]。HO-1高水平的超表达与体外氧的细胞毒性相关联[4-5]。同成人比较，暴露高氧中的新生小鼠HO-1局限于细胞核中[6-7]。本研究对HO-1表达水平与亚细胞定位进行研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1主要实验仪器设备及耗材 全自动生化分析仪(日立7600-110)，液氮冰箱(海尔)，生物组织自动包埋机(KH-BL)，切片机(KH-Q380)，气相色谱仪(北京恒通瑞利 GC6891N)，荧光显微镜(奥林巴斯)。

1.1.2主要试剂及药品 盐酸氯胺酮(西安汉丰药业)，甲苯噻嗪盐酸盐、磷酸盐缓冲液(PBS，武汉普诺赛)，抗血凝素(HA)、抗小鼠肺表面活性物质蛋白(SP-C)抗体、抗波形蛋白抗体、抗α-平滑肌肌动蛋白抗体、抗CD45，核质提取试剂盒(NE-PER,Sigma)。

1.1.3实验对象 实验动物为锦州医科大学实验动物中心提供的SPF级新生小鼠。小鼠分成4组，每组8只，即野生型组(WT组)，特异性转基因小鼠全身高水平表达HO-1组[HO-1-FL(H)组，细胞质]，特异性转基因小鼠全身低水平表达HO-1组[HO-1-FL(L)组，细胞质]和转基因小鼠切去C末端HO-1组(Nuc-HO-1-TR组，细胞核)。

1.2方法 (1)本研究把4组新生的小鼠幼崽分到含正常空气容器和含95%氧气的容器内，其中95%氧气的容器能够连续监测、调节氧和二氧化碳的含量，在此容器内小鼠被暴露于高氧环境中3 d，然后放到正常环境中恢复，一直持续到第2周结束。(2)肺组织收集：小鼠被腹腔注射盐酸氯胺酮(100 mg/kg)和甲苯噻嗪盐酸盐(10 mg/kg)进行麻醉，肺动脉用PBS进行灌注后，切下右肺放入液氮中冷冻保存并进行蛋白质分析，左肺膨胀并用10%中性甲醛固定24 h[8]。肺组织被石蜡包埋制成5 mm厚切片，固定在载玻片上。(3)免疫组织化学：本研究使用生物素化抗增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组织化学染色作为细胞增殖的一般标记，蛋白印记分析作为细胞凋亡的标记。石蜡包埋的组织切片用免疫荧光或修饰后的生物素进行间接染色,切片在4 ℃的温度下和抗血凝素(HA)、PCNA、抗SP-C、抗波形蛋白、抗α-平滑肌肌动蛋白及抗CD45抗体一起过夜孵育，然后在荧光显微镜下进行观察。(4)免疫沉淀，使用NE-PER核质提取试剂盒，抗HA结合到琼脂糖珠上进行免疫沉淀反应[8]：组织裂解液转移至旋转柱，接着加入抗HA琼脂糖珠上4 ℃孵育过夜。旋转柱子移除组织裂解物，洗涤珠子。还有一部分和钙连蛋白(calnexin)抗体进行免疫沉淀，免疫沉淀得到的蛋白质进行洗涤和免疫印记。(5)HO-1活性测定：以 CO 产生量用气相色谱仪进去测定，间接测定出 HO-1活性[9]。

2 结 果

2.1HA标记肺组织的HO-1的表达 用HA标记的HO-1在HO-1-FL(H)组小鼠肺部特异性的高表达，而在其他类型小鼠少量表达或无表达，见图1、2。通过免疫荧光方法观察HA染色的肺泡上皮细胞的表达与分布，在HO-1-FL(H)组中能看到大量的绿色荧光，而在HO-1-FL(L)组和Nuc-HO-1-TR组上有少量的绿色荧光，WT组上没有绿色荧光，HO-1在HO-1-FL(H)组肺泡上皮细胞上大量分布，见图2。

1：WT组；2：Nuc-HO-1TR-组；3：HO-1-FL(L)组;4：HO-1-FL(H)组

图1 HO-1在小鼠肺部的表达

图2 小鼠HA染色(绿色)图和细胞核DAPI染色

2.2肺部HO-1酶活性的测定 总HO-1酶活性HO-1-FL(H)组高于WT组(P<0.05)，HO-1酶活性在HO-1-FL(L)和Nuc-HO-1-TR组与WT组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图3。

2.3在高氧和恢复之后肺泡发育受到损害程度的比较 在正常空气环境中，WT组小鼠发展成有序的通气道，与之相反，WT组新生小鼠暴露高氧环境中3 d，肺泡的发育受到损害，导致肺泡简化和肺组织辐射状肺泡计数(RAC)均显著降低。HO-1-FL(L)组在高氧环境中的RAC也较差，但同暴露在高氧中WT组相比，在正常空气中恢复后，RAC得到了显著的提高。与此相反，Nuc-HO-1-TR组和HO-1-FL(H)组在14 d时后，RAC均得到了显著提高，见图4。

图3 14 d小鼠肺部HO-1酶活性计数

图4 肺泡发育受损程度的比较

2.4高氧暴露后肺细胞增殖和细胞凋亡情况 在正常空气环境中，4组小鼠肺部PCNA阳性细胞数量相差不多。而在高氧环境中，除HO-1-FL(H)组外，其余3组细胞数大量减少，见图5。

图5 高氧暴露3 d 后PCNA免疫组织化学染色(绿色)

3 讨 论

虽然，高氧环境在自然界中尚未证实存在，但是在临床环境和适应性反应中存在这种挑战[10-11]。 暴露在高氧环境中成年啮类目动物被观察到的HO-1的诱发是一种保护作用，但是新生小鼠在同样的条件下，肺部的HO-1没有被诱导[12-13]。本研究先前已经表明，低水平的HO-1表达是有益的[14-15]，但是在体外研究表明HO-1表达的增加也是有益的[8,12]，这就暗示HO-1的有益表达是有阈值的。本课题组的研究表明，HO-1的表达的程度和它细胞内表达定位改变着它在小鼠体内的保护能力。

本研究模拟临床环境，新生转基因小鼠暴露高氧中3 d后，然后放在正常空气中恢复，这个模型用来评估新生小鼠急性肺损伤和修复。同经过3 d高氧环境的WT组相比，HO-1-FL(H)组在第14 d从肺损伤中完全恢复。这表明HO-1在肺上皮细胞中的适度表达在高氧引起的肺损伤的恢复起着至关重要的作用。

综上所述，本研究构建出一种新生小鼠对高氧环境应激反应模型，通过HO-1在转基因小鼠和野生型小鼠肺部表达的对比，研究得出适度的HO-1在肺部表达有益小鼠急性肺损伤的恢复，为进一步的研究工作奠定了坚实的基础。

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Expressionandroleofhemeoxygenase-1inmouselunginjuryinducedbyhyperoxia*

LuoXigang1,WangYi1,ZhangFengxiang2△

(1.LaboratoryCenter,ThirdAffiliatedHospitalofJinzhouMedicalUniversity,Jinzhou,Liaoning121001,China;2.DepartmentofThoracicSurgery,FirstAffiliatedHospitalofJinzhouMedicalUniversity,Jinzhou,Liaoning121001,China)

ObjectiveTo investigate the expression of heme oxygenase-1 in lungs of transgenic mice and normal mice and its effects.Methods32 newborn mice were divided into four groups:wild-type group (WT group),specific transgenic mice expressed hemoglobin oxygenase-1 high level group[HO-1-FL(H) group,cytoplasm],low level WT group[HO-1-FL(L) group,cytoplasm] and the C-terminal heme oxygenase-1 group(Nuc-HO-1-TR group,nucleus).Then four groups of mice were exposed to high oxygen for 3 days,after that placed in normal air environment.Immunohistochemistry and immunofluorescence were used to observe the alveolar development and hemoglobin addition at 3 days,7 days and 14 days oxygenase-1 expression in the lungs of mice.ResultsThe levels of heme oxygenase-1 were significantly higher in the lungs of HO-1-FL (H) group,and the alveolar development in the lungs of the four groups after 3 days of hyperoxia exposure was impaired.In the normal air environment,the recovery of alveolar development in HO-1-FL (H) group on the 7th and 14th day was the best.ConclusionThe moderately high levels of heme oxygenase-1 expression in the lungs contribute to the recovery of lung injury in mice caused by hyperoxic environments.

pulmonary injury;heme oxygenase-1;knockout mice

R-332

A

1671-8348(2017)26-3614-03

2017-02-21

2017-06-06)

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.26.005

国家自然科学基金资助项目(81541099)。

罗喜钢(1980-)，硕士，主管检验师，主要从事体液酶学方面研究。△

，Email：zhangfengxiang64@163.com。