东北地区GLIS3基因多态性与2型糖尿病合并视网膜病变的关联性研究

庄晓彤，陆美子，于秀玲，徐丽

（沈阳市第四人民医院眼科 ，沈阳 110031）

东北地区GLIS3基因多态性与2型糖尿病合并视网膜病变的关联性研究

庄晓彤，陆美子，于秀玲，徐丽

（沈阳市第四人民医院眼科 ，沈阳 110031）

目的探讨GLIS3基因多态性与中国东北地区2型糖尿病合并视网膜病变的相关性。方法采用病例对照研究方法，选取糖尿病合并视网膜病变患者（DR组）、糖尿病未合并视网膜病变患者（DNR组）、健康人群（NC组）各120例为研究对象。应用PCRRFLP方法测定GLIS3基因rs7041847与rs7034200多态的基因分型。用非条件logistic回归计算比值比及95%置信区间。结果DR、DNR组分别与NC组比较，GLIS3基因rs7041847 多态AG、AG/GG基因型、G等位基因患者发病风险显著增加（P ＜ 0.05），rs7034200多态CC、AC/CC基因型、C等位基因患者发病风险显著增加（P ＜ 0.05）。结论在中国东北地区，GLIS3基因rs7041847、rs7034200是2型糖尿病的危险因素，并未发现GLIS3基因与视网膜病变的易感性相关。

2型糖尿病；视网膜病变；GLIS3基因

Abstract ObjectiveTo investigate the correlation between the polymorphisms in GLIS3 and diabetic retinopathy in patients with type 2 diabetes in Northeast China.MethodsBased on the case-control study，polymorphisms in GLIS3 were examined by PCR-RFLP in 120 cases of diabetic retinopathy in patients with type 2 diabetes （DR），120 cases of patients with type 2 diabetes without diabetic retinopathy （DNR），and 120 healthy individuals （NC）. The odds ratio （OR） and 95% confidence interval （CI） were calculated using unconditional logistic analysis.ResultsThe results demonstrated that GLIS3 rs7041847 AG，AG/GG genotype，or G allele was associated with an increased risk of DR and DNR （P ＜ 0.05）. Moreover，GLIS3 rs7034200 CC，AC/CC genotype，or C allele was associated with an increased risk of DR and DNR （P ＜ 0.05）.ConclusionIn the patients in Northeast China，the polymorphisms in GLIS3 rs7041847 and rs7034200 were correlated with type 2 diabetes mellitus，while GLIS3 may not be associated with the susceptibility to diabetic retinopathy.

Keywordstype 2 diabetes mellitus； retinopathy； GLIS3 gene

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是复杂的代谢紊乱综合征，已成为危害公共健康的流行病问题，据估计其发病率占中国成年人群的11.6%。其中，肥胖、家族遗传、运动缺乏及不良生活习惯为T2DM的主要危险因素［1-2］。糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）为糖尿病常见的微血管并发症，能导致患者失明［3-4］。环境因素与遗传因素均在糖尿病及DR的发生发展中发挥重要作用［5-6］。GLIS3基因位于人类染色体9p24.2，为锌指蛋白家族成员之一，主要在胰腺、甲状腺及肾脏中表达。有研究［7］表明GLIS3异常表达会增加T2DM的发病风险。另有研究［8］对美国及东亚地区T2DM人群进行全基因组关联分析，发现GLIS3基因多态与糖尿病相关，中国东北地区此基因与DR的相关性尚未见报道。因此，本研究利用病例对照研究探讨GLIS3基因多态是否与东北地区T2DM及DR患者存在关联。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2011年1月至2015年3月沈阳市第四人民医院眼科门诊及病房根据糖尿病诊断和分型标准由糖尿病专家诊断为T2DM的患者。所有患者均接受眼科专家根据DR入组标准进行的眼科检查。根据检查结果将患者分为糖尿病合并DR组（DR组，120例，其中男52例，女68例），糖尿病未合并DR组（DNR 组，120例，其中男56例，女64例）。选择健康成年体检者为对照组（NC组，120例，其中男63例，女57例）。本研究得到本院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取：抽取研究对象外周静脉血（约3 mL），用酚氯仿法提取全血样本的基因组DNA，紫外分光光度计测定DNA浓度后，-20 ℃保存备用。

1.2.2 多重PCR引物：根据GLIS3基因内含子多态位点附近区域序列，同时考虑接续的限制性内切酶PstⅠ的识别特性进行引物设计，由上海生工合成。rs7041847上游引物序列：5’-GGCCCCTCCTTCCCTT GACtA-3’，下游引物序列：5’-CATCTCTGAAAGACA GATTGTGACAG-3’。rs7034200上游引物序列：5’-T CCAGTTTTCACATTAATTACGCC-3’，下游引物 序列：5’-GCATTTTATCCCTTTTTTTGTTAaCtAG-3’。

1.2.3 多重PCR-RFLP及产物检测：多重PCR是在1个20 μL的PCR反应体系中，包括1×Taq酶（日本TaKaRa公司），10 μmol/L浓度引物2 μL，50 ng的模板DNA。反应条件为94 ℃预变性1 min，94 ℃ ，30 s，50 ℃ ，30 s，72 ℃，30 s，重复35个循环；最后72 ℃ 1 min。反应结束后，将10 μL PCR产物加入含PstⅠ限制性内切酶的反应体系中孵育过夜。酶切产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，紫外灯下观察电泳结果。

1.3 统计学分析

采用统计分析软件SPSS 13.0 进行数据处理。利用t检验分析DR、DNR组和NC组临床资料，采用χ2检验确定对照组基因型频率是否符合Hardy-Weinberg平衡，比较基因型的组间分布频率。采用非条件logistic回归分析不同基因型与DR、DNR组和NC组之间的相关性。P ＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DR、DNR组和NC组的一般特征比较

DR、DNR患者及NC组间年龄分布、性别构成差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。与NC组比较，DR及DNR组的收缩压及舒张压、体质量指数、吸烟史及饮酒史均有统计学差异 （P ＜ 0.05）。DR及DNR组比较，收缩及舒张压、体质量指数、吸烟史及饮酒史等差异无统计学无意义（P ＞ 0.05）。DR组的糖尿病病程较DNR组长，差异有统计学意义（P ＜ 0.05），见表1。DR、DNR组及NC组基因型与等位基因分布显示，rs7041847位点DR、DNR组与NC组基因频率比较有统计学差异（P ＜ 0.05），DR与DNR组基因频率比较无统计学差异（P ＞ 0.05）。rs7034200位点 DR、DNR组与NC组基因频率比较有统计学差异（P ＜ 0.05），DR与DNR组基因频率比较无统计学差异（P ＞ 0.05）。GLIS3基因rs7041847与rs7034200 NC组的基因型频率符合Hanly-Weinberg平衡，具有群体代表性。见表2。

2.2 GLIS3基因多态性与糖尿病合并/未合并DR发病风险的相关性

如表2所示，对GLIS3基因rs7041847进行logistic回归分析，以AA基因型或A等位基因作为对照进行危险度评价。DR组与NC组相比，rs7041847 AG、AG/GG基因型、 G等位基因患者发病风险显著增加（均P ＜ 0.001）。同时，DNR组与NC组相比也有类似结果（均P ＜ 0.001）。

表1 3组患者临床特征情况比较Tab.1 Comparison of clinical characteristics in the three groups

表2 GLIS3基因多态位点基因型分布频率与糖尿病合并DR发病风险的相关性Tab.2 Genotype frequencies of the GLIS3 polymorphisms among the three groups and their association with diabetic retinopathy in patients with a risk of type 2 diabetes

对GLIS3基因rs7034200进行logistic回归分析，以AA基因型或A等位基因作为对照进行危险度评价。DR组与NC组相比，rs7034200 CC、AC/CC基因型、C等位基因患者发病风险显著增加（均P ＜ 0.05）。DNR组与NC组相比也有类似结果（均P ＜ 0.05），见表2。

3 讨论

糖尿病患者的高血糖状态是微血管并发症的高危因素，DR为糖尿病最常见的并发症之一［9］。近期研究［10］预测DR人群在2030年将增加至1.91亿。DR是一个复杂过程且存在种族差异及地域差异，危险因素包括不良血糖控制、糖尿病、吸烟、炎症反应、肥胖与高血压。STRATTON等［11］发现不良血糖控制及糖尿病是DR的独立危险因素。然而，关于DR的具体病理生理机制尚不十分清楚。

遗传基因不同也影响着糖尿病及DR的发生发展，有许多学者从基因水平探索糖尿病及DR的发生机制，筛选相关基因，并从表观遗传学、基因组学、基因多态以及信号通路等角度分析DR的遗传易感性［12-14］。GLIS3作为糖尿病的易感基因，最初在胰腺（主要在β细胞）中表达，其突变会引起新生儿糖尿病［15-16］。全基因组关联分析［17］揭示GLIS3多态与1型糖尿病和T2DM在不同人种中均存在显著关联。

本研究发现在GLIS3位点rs7041847中，与AA基因型或A等位基因相比，AG、AG/GG基因型、G等位基因患者发病风险显著增加；在位点rs7034200中，与AA基因型或A等位基因相比，CC、AC/CC基因型、C等位基因患者发病风险显著增加。DR组与DNR组进行2个多态位点基因型对比分析差异无统计学意义，说明GLIS3基因的2个多态位点可能不参与DR的发生发展，因此未对DR与DNR组进行后续logistic分析。本结果表明GLIS3基因多态与东北地区T2DM相关，且rs7041847的G等位基因、rs7034200的C等位基因为遗传高危因子。

病例对照研究也有一些不足，基于医院的病例设计可能存在病例的内在选择偏倚。因此，基于医院的病例对照研究结果应在将来被基于人群的前瞻性研究进一步验证。此外，由于这些位点的等位基因频率相对较低，这些多态位点的潜在临床应用也许不能实现。因此希望能够开展设计更合理、更多大样本、更多种族类型的相关研究，为明确糖尿病合并DR的发生发展提供思路。

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（编辑 武玉欣）

Polymorphisms in GLIS3 Associated with Diabetic Retinopathy in Patients with Type 2 Diabetes in Northeast China

ZHUANG Xiaotong，LU Meizi，YU Xiuling，XU Li

（Department of Ophthalmology，The Fourth People’s Hospital of Shenyang，Shenyang 110031，China）

R774.1

A

0258-4646（2017）10-0909-04

http://kns.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20170927.1452.022.html

10.12007/j.issn.0258‐4646.2017.10.011

沈阳市科学技术计划（F16-206-9-25）

庄晓彤（1978-），女，副主任医师，博士.

徐丽，E-mail：xu-li1149@163.com

2017-02-12

网络出版时间：2017-09-27 14:52