高脂联合LPS诱导小鼠胰岛炎症模型

姜宏卫，马瑜瑾，王霖蕾，张颖裕，彭慧芳，郑 伟

·基础医学·

高脂联合LPS诱导小鼠胰岛炎症模型

姜宏卫，马瑜瑾，王霖蕾，张颖裕，彭慧芳，郑 伟

目的 探索饮食相关的胰岛炎症小鼠动物模型的构建方法。方法 用高脂喂养结合脂多糖（LPS）处理诱导小鼠胰岛炎症的发生，并用LiCl作为炎症拮抗剂，通过不同方式及不同剂量LPS和LiCl筛选、糖耐量和组织形态结构的观察来检测不同诱导条件下小鼠胰岛炎症发生情况。结果 高脂饮食可以引起小鼠显著的体质量升高，糖耐量发生变化，经300μg·kg-1·d-1皮下注射LPS连续6 d处理后，糖耐量并未发生进一步变化，但是胰岛炎症进一步加强，而6 d 120 mg·kg-1LiCl对所诱导的炎症有一定的拮抗作用。结论 长期高脂喂养加上LPS处理能够有效地用于小鼠胰岛炎症模型构建，LiCl可用于该模型炎症阻断。

糖耐受；高脂饮食；脂多糖；胰岛炎症

Abstract：Objective This study was designed to explore the diet-related modeling method of islet inflammation mouse models. Methods High-fat diet and lipopolysaccharides（LPS）treatments were used to induce pancreatic islet inflammation in mice，and LiCl was used as an antagonist for the inflammation.The treatment way and dosage of LPSand LiCl were detected.Glucose tolerance and morphological structure were employed to show the inflammation effects of different treatments in mice. Results High-fat diet could result in significant weight gain and glucose tolerance changes in mice.After 300μg·kg-1·d-1LPS subcutaneous injection for 6 days，the glucose tolerance did not change any more，but the islet inflammation was further strengthened.120 mg·kg-1of LiCl for 6 days had antagonistic effects on inflammation induced by high fat diet and LPS. Conclusion Long-term high-fat diet and LPS treatment can effectively be used in the islet inflammation model in mice，and LiCl can be used for blocking inflammation in this model.

Key words：glucose tolerance；high fat diet；lipopolysaccharide；pancreatic islet inflammation

肥胖及糖尿病等慢性代谢紊乱性疾病的发病人数正日益攀升，造成了重大的社会负担，其中2型糖尿病中以慢性低度炎症为特征的中心性肥胖及超重人数越来越多。2型糖尿病的慢性低度炎症是由生活方式所诱导的，高脂饮食引起的代谢性内毒素血症和慢性低度炎症促进肥胖及糖尿病的发生发展［1］。许多报道指出，多数2型糖尿病人存在胰岛炎症，表现为胰岛相关巨噬细胞数目升高，胰岛素活性下降，淀粉样蛋白堆积等［2-4］。因此构建动物胰岛炎症模型对肥胖及糖尿病相关的研究有重要意义。

脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）是革兰阴性菌菌壁的主要组成部分，可启动炎症，导致内毒素血症。长期低剂量LPS所致的低度炎症状态，是肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪肝和慢性炎症性肠病等的发病机制之一［5-6］，并且摄入过度的脂肪同样可启动血液循环中 LPS的升高［7］，给予外源性 LPS及高脂饮食被广泛用于诱导炎症模型。

GSK-3β是NF-κB的重要调控因子，在调节机体炎症与抗炎平衡中发挥重要作用［8］。LiCl是常用的GSK-3β抑制剂，可通过抑制肌醇单磷酸酶，使肌醇、IP3下降而诱导自噬，且不依赖于 mTOR途径［9］，对炎性信号通路GSK3β的抑制可减轻炎症反应。

本实验对小鼠胰腺炎症模型进行探索，选用高脂及高脂加LPS进行诱导，以及LiCl对诱导炎症的阻断作用，通过对干预方式及剂量的筛选，以及糖耐量等相关指标和形态结构的观察，制备小鼠胰腺炎症模型以及炎症阻断模型，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康7～8周龄 c57BL／6J雄性小鼠，体质量（21±2）g，购自北京华阜康公司，于河南科技大学第一附属医院新区医院动物饲养中心饲养。SPF级饲养，温度20～25℃，湿度40%～60%，12 h／12 h昼夜节律。笼具定期清洗消毒，每周更换一次垫料。实验前所有小鼠适应性喂养1周，不限制摄食和饮水，动物实验的过程遵循《中华人民共和国实验动物管理条例》与伦理要求。

1.2 高脂诱导 随机分配小鼠为两组，对照组10只，标准饲料喂养7周；高脂组30只，高脂饲料喂养7周。不限饮水，其他饲养条件正常。标准饲料成分：脂肪10%，蛋白质20%，碳水化合物70%；高脂饲料成分：脂肪 60%，蛋白质 20%，碳水化合物20%［10-11］。每周对小鼠体质量及饲料进行称重，评估平均每日摄食量及体质量变化。

1.3 小鼠胰岛炎症模型

1.3.1 LPS干预方式及剂量实验 LPS干预方式选择微量泵、皮下注射、腹腔注射3种方式：微量泵选择300μg·kg-1·d-1持续给药；皮下注射剂量分别为：300、600（300μg·kg-1·d-1×2次）、900（300μg·kg-1·d-1×3次）μg·kg-1·d-1；腹腔注射剂量分别为：100、150、300、600（300μg·kg-1·d-1×2次）、900（300μg·kg-1·d-1×3次）μg·kg-1·d-1。每种给药方式及给药剂量各处理6只小鼠。

1.3.2 LiCl干预剂量 LiCl选择腹腔给药，剂量分别为：预实验分别选取 50、100、120、180、240 mg·kg-1·d-1，干预 6 d。每个给药剂量各处理 6只小鼠。

1.3.3 实验动物干预 将2.2中处理结束的小鼠重新分组，如下：原对照组为A组，仍为对照组，注射等计量的生理盐水为对照；原高脂饲养组随机分为B、C、D 3组，每组 10只，其中 B组：高脂组，高脂饲料喂养，不限饮水，注射等计量的生理盐水；C组：LPS组，高脂饲料喂养 +LPS处理（第8～11周）；D组：LiCl组，高脂饲料喂养 +LPS处理（第8～11周）+LiCl处理（第11周）。

1.4 糖耐量检测 于实验第7周末和11周末进行糖耐量实验。试验前，各组小鼠更换垫料并禁食12 h，按1.0 g·kg-1剂量腹腔注射葡萄糖，分别测量注射后 0、15、30、60、120 min时小鼠血糖，用罗氏血糖仪及配套试纸检测5个时间点尾静脉血糖。

1.5 组织切片 给药处理结束后，脱颈法处死小鼠，取胰腺组织置于4%甲醛中固定24 h，放入包蜡盒内进行梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片机以4μm厚度切片，切片完成后将玻片置于烤片机中30 min（温度68℃），室温保存。HE染色，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.6 统计方法 本实验所有数据使用统计软件SPSS 19.0处理，采用重复测量方差分析，以及协方差分析，P＜0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 高脂对小鼠体质量及胰岛功能的影响 处理过程中，小鼠生长状态较好，进食饮水正常，精神无明显异常。高脂饮食（B组）小鼠体质量增加较快，在第3周时，平均体质量为27.39 g，高于对照组（A组）小鼠的平均值 23.61 g（P＜0.05）；第 7周时，B组小鼠平均体质量32.82 g，而 A组平均值为25.56 g，两组比较有统计学差异（P＜0.05），结果如图1所示。第7周饲养结束，对两组小鼠进行糖耐量实验，结果如图2所示，糖负荷后15 min，两组小鼠血糖均达高峰，15～30 min血糖水平开始下降，30 min时高脂组血糖显著高于对照组（P＜0.05），计算曲线下面积（area under curve，AUC），高脂组显著高于对照组（P＜0.05），表明高脂可导致小鼠糖耐量出现受损现象。

2.2 LPS干预方式和剂量 不同干预方式及剂量LPS处理下各组小鼠的情况如表1所列，微量泵和皮下注射方式干预的小鼠精神状态均良好，未出现反应迟钝等现象。但微量泵持续给药植入口已发生开裂，造成微量泵脱落，对给药有一定的影响和不便。3个浓度的皮下注射均未对小鼠精神状态有明显不利影响，但高剂量的皮下给药需多次注射，容易造成实验小鼠皮肤破溃、结痂等明显损伤。各剂量的腹腔给药均引发小鼠精神状态差，且与剂量正相关，较低剂量引起进食量减少，高剂量则引发明显反应迟钝和处理后死亡现象。综合以上结果，为避免LPS对实验小鼠引起显著精神负影响以及明显伤口，应选择的LPS给药剂量和给药方式为300μg·kg-1·d-1皮下注射，给予4周处理。

图1 高脂饮食诱导7周后小鼠体质量的变化

图2 高脂饮食诱导7周后小鼠葡萄糖耐量（A）及其曲线下面积（B）比较

表1 LPS干预后小鼠情况

（续表）

2.3 LiCl浓度 5个 LiCl处理浓度，50～240 mg·kg-1，均对小鼠精神状态无明显影响，如表2所示，但高浓度处理会引起不同处理时间小鼠脱毛现象，故LiCl处理浓度应不高于120 mg·kg-1，本实验选用腹腔注射每天每次120 mg·kg-1，处理6 d。

表2 LiCl不同剂量干预后小鼠情况

2.4 LPS和LiCl处理对小鼠的作用 LPS给药第1周，C、D组小鼠进食量、活动有所减少，对外界刺激稍显迟钝；对照组及单纯高脂组（A、B组）小鼠无明显改变。处理结束后对各组小鼠进行糖耐量实验，如图3A所示，与对照组（A组）相比，高脂组（B组）和 LPS组（C组）空腹血糖显著升高（P＜0.05），LiCl组（D组）空腹及120 min时的血糖与A组无统计学差异（P＞0.05），在 15 min、30 min、60 min时间点，B、C、D组血糖与A组相比均有统计学差异（P＜0.05）；计算 AUC值显示（图 3B），B、C、D组与 A组相比均显著升高，且LiCl组糖负荷60 min时血糖值以及AUC值与 LPS组相比均显著降低（P＜0.05）。

2.5 各组小鼠胰岛组织形态变化 本实验通过HE染色观察各组小鼠胰岛的形态学改变，结果如图4所示，光镜下，A组小鼠胰腺内分泌部的胰岛与外分泌部的腺泡清晰可见，胰岛呈团状，胰岛之间排列紧密，细胞呈圆形；B组胰岛内偶见脂滴空泡，腺泡结构稍松散，可见散在单个炎细胞浸润；C组腺泡失去正常组织结构，小叶缺失、间隙增大，部分腺泡呈孤岛状，炎性细胞浸润，岛内细胞未见明显炎细胞浸润；D组腺泡未见明显孤岛结构，偶见炎细胞浸润。

图3 第11周末小鼠葡萄糖耐量试验结果

图4 各组小鼠胰岛形态变化（HE，×400）

3 讨论

3.1 高脂引起糖耐量变化 高脂为肥胖、胰岛素抵抗的“导火线”，高脂构建动物模型喂养周期较长，但能够更好模拟胰岛素抵抗的发生过程，操作简便，被多数研究者选用［12］。另外高脂喂养可导致动物血液中内源性LPS水平升高［7］。本实验用高脂喂养小鼠7周后进行IPGTT实验，对小鼠胰岛功能进行评估，结果表明高脂喂养确实会对小鼠糖耐量有显著影响，这可能是由于长期高脂诱导所导致胰岛β细胞功能受损。

3.2 LPS诱导炎症 LPS作为菌壁成分之一，被广泛用于诱导炎症反应。用微量泵持续皮下泵入LPS（300 μg·kg-1·d-1），连续 4周，可导致代谢性内毒素血症，引起炎性因子的表达［12］。LPS给药方式及剂量不同，制备的炎症模型亦不同。常见的给药方式有腹腔给药、皮下给药、灌胃及静脉注射给药；腹腔注射通过肠系膜静脉系统吸收，因吸收面积大、速度快，常用于急性模型；皮下给药通过微血管、淋巴管吸收入血，因皮下血管少，吸收速度慢，可用于制备慢性模型；灌胃给药产生的首过效应，影响入血药量；静脉给药，包括颈静脉及尾静脉注射，药物直接入血，可用于急性模型制备。文献报道，单次注射给药构建的急性炎症大鼠模型中，尾静脉给药分别采用了 5、7.5、10、20 mg·kg-1，腹腔给药剂量从 1～10 mg·kg-1不等［13-17］。慢性炎症模型的诱导，部分研究者采用5 mg·kg-1或10 mg·kg-1剂量单次腹腔给药，处理时间为 1、3、10个月［18-19］；部分用 0.25 mg·kg-1，每周两次腹腔给药，持续 12周［20］；Kitazawa M等用 LPS 0.5 mg·kg-1腹腔注射，2周1次，持续6周［21］。本实验中腹腔注射后小鼠耐受差，给药后小鼠进食量明显减少、精神差、对外界刺激反应迟钝，且腹腔多次给药，会引起小鼠死亡的发生（见表1），不适合慢性模型的制备。而皮下植入微量泵300μg·kg-1·d-1，时间过长则易发生因伤口张力大而造成的伤口开裂，调整缝合方式后伤口裂开间期延长，但伤口红肿，可能影响实验相关炎性指标。一天多次皮下注射易导致皮肤破溃、结痂，影响药物吸收。每天单次皮下注射（300μg·kg-1·d-1）组各小鼠耐受性好，在干预期间未出现死亡现象，故本实验选取 LPS皮下给药，剂量为300 μg·kg-1·d-1，持续 4周。

3.3 LiCl阻断 作为GSK3β的抑制剂，LiCl被应用于相关研究中，LiCl腹腔给药，其他给药方式少有报道，故本实验选用腹腔给药方式，剂量为50～240 mg·kg-1之间，结果显示，高剂量（240 mg·kg-1、180 mg·kg-1）会引起小鼠不同程度的脱毛现象，相对低剂量则无明显不良影响，综合考虑，本实验推荐使用120 mg·kg-1剂量腹腔注射，干预期为6 d。

3.4 炎症模型 在肥胖和糖尿病人群高脂饮食情况下，游离脂肪酸和神经酰胺水平升高，作用于NLRP3炎症复合体，刺激炎性因子的释放，导致全身系统性炎症反应［22］。用 LPS刺激胰岛素瘤细胞可以使其分泌炎性因子 IL-1β，导致胰岛细胞损伤［23］，高脂饮食4周诱导的系统性炎症反应类似于低剂量LPS皮下输注4周引起的代谢性内毒素血症［24］。小鼠LPS干预6周联合高脂3周，可影响炎症水平，但未出现糖耐量异常及脂代谢改变［25］。本实验结果与现有的报道相一致，LPS干预4周后，各时间点血糖明显高于对照组（A组），但与高脂组（B组）相比无统计学差异；给予LiCl干预后，在糖负荷后60 min时血糖及糖耐量曲线下面积与LPS组相比均明显下降，差异有统计学差异，这说明LPS并未显著加重由高脂饮食诱导的糖耐量受损；LiCl干预后小鼠糖耐量有所改善，提示LiCl能拮抗高脂及LPS诱导产生的糖耐量受损，这可能是通过对胰岛β细胞功能的保护而起作用的。结合组织切片结果，高脂诱导和高脂加LPS诱导均引起小鼠胰岛一定程度的结构破坏，而LiCL处理组可以对这种破坏起到一定的拮抗保护作用。说明在高脂7周加300μg·kg-1·d-1皮下注射 LPS 4周诱导的小鼠胰岛炎症模型中，120 mg·kg-1LiCl连续6 d腹腔给药干预便可起到拮抗作用。

在小鼠胰岛炎症模型诱导过程中，长期高脂饮食可以刺激相关炎症反应的发生，LPS可以增加炎症的效果，但是并不加重高脂饮食对机体糖耐量的影响，适合剂量的LiCl可以有效拮抗LPS对胰岛细胞的炎症作用。

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Pancreatic Islet Inflammation Mice Model Induced by High Fat and LPS

JIANG Hong-wei，MA Yu-jin，WANG Lin-lei，ZHANG Ying-yu，PENG Hui-fang，ZHENG Wei
（1.Department of Endocrinology，First Affiliated Hospital，and College of Clinical Medicine of Henan University of Science and Technology，Luoyang471003，China；2.Medical College，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471023，China）

R587；R589.2

A

1672-688X（2017）03-0161-05

10.15926／j.cnki.issn1672-688x.2017.03.001

国家自然科学基金（U1404805）

2017-05-27

1.河南科技大学临床医学院，河南科技大学第一附属医院，

河南洛阳471003

2.河南科技大学医学院，河南洛阳 471023

姜宏卫（1974—），男，河南范县人，副主任医师，从事内分

泌相关临床及研究工作。