Slug与KISS-1在肝细胞癌的表达与意义

赵延兵，秦 雯，张 伟，牛馨苗，付俊敏，李世朋

Slug与KISS-1在肝细胞癌的表达与意义

赵延兵1，秦 雯1，张 伟1，牛馨苗1，付俊敏2，李世朋1

目的 探讨Slug与KISS-1在肝细胞癌组织中表达与意义。方法 采用qRT-PCR与免疫组织化学法检测肝细胞癌组织和正常肝脏组织中Slug与KISS-1的mRNA及蛋白水平的表达。结果 肝细胞癌组织中Slug mRNA表达明显高于正常肝脏组织，而肝细胞癌组织中KISS-1 mRNA表达明显低于正常肝脏组织（均P＜0.05）；肝细胞癌组织中Slug蛋白阳性率高于正常组织，而KISS-1蛋白阳性率低于正常组织（均P＜0.05）；且两者表达呈负相关（r＝-0.877，P＜0.05）。结论 Slug与KISS-1在肝细胞癌中的表达呈负相关，二者在肝细胞癌发生发展、侵袭转移过程中可能存在拮抗作用。

Slug；KISS-1；肝细胞癌；mRNA；

Abstract：Objective To investigate the expression and its significance of Slug and KISS-1 in hepatocellular carcinomas. Methods qRT-PCR and immunohistochemistry were used to detect the mRNA and protein expression of Slug and KISS-1 in the cancer tissues from hepatocellular carcinomas and normal tissues. Results The expression of Slug mRNA in hepatocellular carcinoma was higher than that in normal liver tissues.However，the expression of KISS-1 mRNA in hepatocellular carcinoma was lower than that in normal liver tissues（all P＜0.05）.The positive rate of Slug protein was significantly higher in the cancer tissues than that in normal tissues，but the positive rate of KISS-1 protein was significantly lower in cancer tissues than that in normal tissues（all P＜0.05）.There was a negative correlation between the two expressions（r＝-0.877，P＜0.05）. Conclusion The expression of Slug was negative correlation to KISS-1 in hepatocellular carcinomas，and they might play antagonistic action in the process of development and metastasis of hepatocellular carcinomas.

Key words：Slug；KISS-1；hepatocellular carcinoma；mRNA

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我国常见的恶性肿瘤之一，因其恶性程度高、侵袭力强而易发生转移，肝癌患者预后较差［1］。近些年来，发现核因子Slug在骨肉瘤发生和进展中发生作用［2］。而KISS-1基因是在人类黑色素细胞株中发现的肿瘤转移抑制基因，其异常表达与结肠癌细胞发生、发展存在着密切的关系［3］。本文通过分子生物学技术检测Slug、KISS-1在肝细胞癌组织中表达，分析两者的相关性，为肝细胞癌浸润和转移的研究提供理论依据，报道如下。

1 材料与方法

1.1 组织标本 本研究标本收集于焦作市人民医院2004年9月至2014年12月接受肝癌切除手术治疗的30例患者。其中新鲜冻存的肝癌组织12例与存档的石蜡标本30例。另取20例正常肝脏组织标本（新鲜冻存的组织标本9例与存档石蜡标本20例），所有病例均由两位病理医师诊断，病理类型均为肝细胞癌，所有病例均有完整临床病历资料。

1.2 主要试剂与仪器 总RNA提取试剂盒（Sigma-Aldrich公司，美国），反转录试剂盒（TaKaRa公司，日本），引物（Slug，F：GGCACTTAGACCACCTTA，R：AAATCCCTCATAATAGACAC；KISS-1，F：ACCTGCCGAACTACAACTGG，R：TCCCTTAGCCCTACGTCCC；β-actin，F：CATGTACGTTGCTATCCAGGC，R：CTCCTTAATGTCACGCACGAT）购于上海生工公司，荧光定量试剂盒（Roche公司，瑞士），兔源一抗 Slug（CST公司，美国）和KISS-1（CST公司，美国），二步法免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。主要仪器：iQ5荧光定量 PCR检测系统（Bio-Rad，美国），LabWorksTM凝胶成像及分析系统（UVP，美国），F-4500型荧光检测仪（HITACHI，日本），UV-2000型可见／紫外分光光度计（UNICO，美国）。

1.3 QRT-PCR检测 Slug与 KISS-1 mRNA表达肝脏组织总RNA提取参照试剂盒说明进行，然后逆转录合成 cDNA作为模板，qRT-PCR反应条件：56℃，10 s；95℃，5 min；95℃；20 s；循环 35次，60℃，1 min，50μL反应体系。目的基因量 ＝2-△△CT，2-△△CT表示的是实验组目的基因表达相对于对照组变化的倍数。△△CT ＝实验（CT目的基因-CTβactin）-对照（CT目的基因-CTβ-actin）。

1.4 免疫组化检测 Slug与 KISS-1表达与分布将肝脏石蜡标本作连续切片，63℃烤片，然后脱蜡、水化、3%H2O2孵育 22 min；微波炉抗原修复 12 min，然后自然缓慢冷却至室温。然后按照免疫组化试剂盒说明书进行染色，一抗（Slug与 KISS-1）4℃湿盒中孵育过夜。然后滴加含有二抗的工作液，最后DAB试剂盒显色，然后复染、脱水、透明、封片与镜检拍照。采用半定量积分法依据染色强度和阳性细胞百分率判断染色结果［3］。

1.5 统计学分析 应用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。独立样本的比较采用t检验，构成比的比较采用 χ2检验，相关性分析采用 Spearman相关检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 qRT-PCR结果 肝细胞癌组织中Slug mRNA表达水平（19.75±2.45）明显高于正常肝脏组织（6.15±1.65），差异有统计学意义（P＜0.5）；而肝细胞癌组织中 KISS-1 mRNA表达水平（13.75±3.79）明显低于正常肝脏组织（1.95±0.35），差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 免疫组化结果 Slug蛋白染色主要定位于肝癌细胞核内，KISS-1蛋白染色主要存在于肝癌细胞浆内，见图1。Slug在肝细胞癌组织中的表达明显高于正常肝脏组织，差异有统计学意义（χ2＝12.167，P＜0.001），见表1。KISS-1蛋白在肝细胞癌组织中的阳性率显著低于正常肝组织，差异有统计学意义（χ2＝25.301，P＜0.001），见表 2。采用配对资料的检验；表明两种蛋白在肝细胞癌中的表达存在负相关（rs＝-0.877，P＜0.001），见表 3。

图1 Slug和KISS-1蛋白在肝细胞癌中的表达

表1 Slug在不同肝脏组织中的表达 例

表2 KISS-1在不同肝脏组织中的表达 例

表3 Slug与KISS-1在肝癌组织表达的相关性 例

3 讨论

癌细胞侵袭和转移是影响肝细胞癌预后的重要因素之一，遗传表观学与分子生物学研究表明肿瘤细胞一些基因活性的改变及其表达产物在恶性肿瘤的发生发展、侵袭转移和预后等一系列病理生理过程中发挥着关键作用［4-5］。研究发现Slug的异常激活可促进肿瘤细胞生长、增殖，增强肿瘤细胞的运动、侵袭能力，同时抑制细胞凋亡［6］。Snail、Slug和KAI1蛋白的表达水平在宫颈鳞状细胞癌（cervix squamous cell carcinoma，CSCC）组织中与肿瘤组织的分化程度、国际妇产科联盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，IFGO）分期、浸润深度、淋巴结转移与否及预后等均有关，在 CSCC组织中早期联合检测 Snail、Slug和 KAI1对判断预后有价值［7］。RT-PCR半定量结果显示 HIF-1α、MT、Slug和E-钙黏附蛋白在乳腺癌中的表达可作为监测乳腺癌发展的指标［8］。本研究在肝细胞癌组织中 Slug mRNA表达明显高于正常肝脏组织，同时，肝细胞癌组织中的Slug蛋白水平明显高于肝脏正常组织。结果提示，Slug的异常表达在促进肝癌细胞生长、增殖，促进细胞运动、侵袭过程中可能发挥重要作用。

KISS-1基因是一种肿瘤转移抑制基因，能明显抑制肿瘤细胞的生物学行为，并有限制肿瘤细胞侵袭与迁移的能力。过表达的KISS-1可明显抑制大肠癌细胞的侵袭能力，并通过 PI3K／AKT NF-κB通路降低基质金属蛋白酶9（matrix metalloprotein 9，MMP-9）的表达［9］。将过表达 KISS-1重组质粒转染至SW480结肠癌细胞，过表达KISS-1组细胞增殖率明显低于对照组，且高表达KISS-1组细胞划痕损伤愈合的速度明显下降。因此，高表达KISS-1可抑制结肠癌 SW480细胞的增殖，降低细胞迁移速度［10］。KISS-1基因甲基化状态有望成为评估结直肠癌转移风险的重要指标［11］。而且，KISS-1对宫颈癌的浸润及转移有抑制作用，联合检测KISS-1和MMP-2的表达有望成为判定宫颈癌浸润及转移能力的重要指标之一［12］。在肝癌组织中，KISS-1和MMP-9的表达呈负相关性，KISS-1和MMP-9的表达失衡与肝癌细胞侵袭转移有关，KISS-1的缺失表达可作为预测HCC转移潜能的参考指标［13］。

本研究中肝细胞癌组织中KISS-1 mRNA及蛋白水平较正常肝脏组织均降低。同时，本研究表明Slug与KISS-1在肝细胞癌组织中的表达呈负相关（r＝-0.877，P＜0.001）。因此推测 Slug和 KISS-1在肝细胞癌发生发展、侵袭转移过程中可能存在拮抗作用。

［1］ 汤钊猷.肝癌诊治现状与前景［J］.中国普外基础与临床杂志，2003，10（3）：191.

［2］ 伍锋，尹科，龙秋平，等.骨肉瘤组织中 Slug和 E钙粘蛋白的表达意义［J］.中国现代医学杂志，2014，24（13）：28-32.

［3］ 蔡阳阳，何涛，张新，等.Smo和 Gli1蛋白在子宫内膜癌中的表达及其临床意义［J］.河南科技大学学报（医学版），2016，34（4）：247-251.

［4］ Fan X，Ma X，Cui L，et al.CARF activates beta-catenin／TCF signaling in the hepatocellular carcinoma［J］.Oncotarget，2016，7（49）：80404-80414.

［5］ Yada M，Miyazaki M，Motomura K，et al.The prognostic role of lactate dehydrogenase serum levels in patients with hepatocellular carcinoma who are treated with sorafenib：the influence of liver fibrosis［J］.J Gastrointest Oncol，2016，7（4）：615-623.

［6］ Jue C，Zhifeng W，Zhisheng Z，et al.Vasculogenic mimicry in hepatocellular carcinoma contributes to portal vein invasion［J］.Oncotarget，2016，7（47）：77987-77997.

［7］ 龚晓萌，陶仪声，周蕾，等.宫颈癌中 Snail、Slug和 KAI1的表达及临床意义［J］.南方医科大学学报，2015，35（12）：1733-1738.

［8］ 龙方懿，印国兵，刘智敏，等.HIF-1α、MT、Slug和 E-cadherin在人乳腺癌中的表达及其意义［J］.中国免疫学杂志，2012，28（6）：502-506.

［9］ Chen S，Chen W，Zhang X，et al.Overexpression of KISS-1 reduces colorectal cancer cell invasion by downregulating MMP-9 via blocking PI3K／Akt／NF-kappaB signal pathway［J］.Int J Oncol，2016，48（4）：1391-1398.

［10］钟华，刘迪群，吴雪艳.高表达 KISS-1对结肠癌 SW480细胞增殖和迁移的影响［J］.安徽医科大学学报，2014，49（12）：1697-1700.

［11］陈志华，林素勇，陈绍勤，等.结直肠癌组织中 KISS-1基因启动子甲基化对其表达水平的影响及其临床意义［J］.吉林大学学报（医学版），2014，40（5）：1074-1079.

［12］张小平，李明玉.KISS-1蛋白和 MMP-2在宫颈癌中的表达及临床意义［J］.中国实验诊断学，2013，17（3）：507-510.

［13］ 臧盛兵，刘景丰，王斌，等.KISS-1、KISS-1R及 MMP-9表达与肝细胞癌侵袭转移的关系及意义［J］.中华肝胆外科杂志，2011，17（3）：223-227.

Expression and Its Significance of Slug and KISS-1 in Hepatocellular Carcinomas

ZHAO Yan-bing1，QIN Wen1，ZHANG Wei1，NIU Xin-miao1，FU Jun-min2，LI Shi-peng1
（1.Second Department of General Surgery，Jiaozuo People′s Hospital，Jiaozuo 454002，China；2.Key Laboratory of Pharmacology and Medical Molecular Biology，Medical College，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China）

R735.7

A

1672-688X（2017）03-0166-03

10.15926／j.cnki.issn1672-688x.2017.03.002

河南省教育厅自然科学研究项目（2007310002）

2017-01-14

1.焦作市人民医院普外二区，河南焦作454002 2.河南科技大学药理学与医学分子生物学重点实验室，河南洛阳471003

赵延兵（1975—），男，河南温县人，副主任医师，从事普外疾病的诊治与研究工作。