等温扩增技术的原理及其在病原检测中的应用

1 环介导等温扩增技术

1.1 原理

环介导等温扩增(LAMP)是Notomi T等[3]于2000年建立的在恒温条件下仅用一种酶进行核酸快速扩增的技术。①引物设计：针对靶基因3′端的F3c、F2c和F1c区及5′端的B1、B2和B3区6个特异位点设计4种引物，上游内引物FIP由F1c和F2组成，下游内引物BIP由B1c和B2组成，上游外引物F3与F3c互补，下游外引物B3与B3c互补。②哑铃状模板构造的形成：FIP引物中的F2序列与模板DNA上F2c结合，在链置换DNA聚合酶的作用下向前延伸并启动链置换反应，外引物F3与模板F3c区域结合，共同置换出FIP延伸的单链，此单链上F1c与F1互补，碱基配对形成环状结构。以此链为模板，BIP引物与其结合并延伸，同时环状结构被打开。随后，B3在聚合酶作用下置换出新的互补链，被置换的单链两端均存在互补序列，可发生自我碱基配对形成哑铃状DNA结构。③扩增循环：以哑铃状结构为模板，FIP与其F2c区结合开始链置换合成，通过再循环和延伸得到长度不同的DNA产物。整个过程在63℃左右45 min～60 min即可完成。其技术原理见图1。

1.2 优缺点

优点：该方法在等温条件下进行，不需要循环仪等昂贵的仪器；扩增反应快，一般在1 h内完成；扩增产生的特异性产物含量较大，通过肉眼、电泳或比浊仪均可判定结果；敏感性高、特异性强，极适用于病原检测。

缺点：对引物设计要求极高，设计的4条引物Tm互有差别且需要识别6个不同的区域[4]。扩增的靶序列长度需控制在300 bp以下，故不能扩增较长的目的片段。由于灵敏度高，在操作中极易出现假阳性，故试验要严格区分溶液配制区、样品处理区和检测区。

a．引物设计位点；b．哑铃状模板构造形成的原理图 a．Primer design site；b．The schematic of forming dumbbell-shaped template structure

1.3 发展与应用

最初LAMP引物设计采用2对引物识别6个位点，后来Nagamine K等[5]建立了一种通过加入额外的引物(环引物)加速LAMP反应的方法。改进的LAMP方法采用环引物，反应时间比原始LAMP方法缩短一半。虽然内引物和环引物都通过环反应，但它们的反应机制不同。Hong T C等[6]研究出一种新型的逆转录LAMP检测方法，在LAMP反应混合体系中加入病毒逆转录酶，实现一步法扩增，可快速检测非典型肺炎病毒(Severe acute respiratory syndrome virus，SARSV)。结果显示，RT-LAMP最低检测限为0.01 pfu，而RT-PCR只能检测1 pfu，因此，RT-LAMP的灵敏度较RT-PCR提高了100倍；RT-LAMP的检测特异性是100%，而RT-PCR是87%。

近年来，LAMP已用于多种细菌和病毒的检测。其中将逆转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)与化学发光(chemiluminescence，CL)结合建立的H7N9病毒检测方法，经优化可检测到103拷贝/mL的H7N9流感病毒RNA，与RT-PCR-CL相比，处理时间显著缩短[7]。同时LAMP还可与胶体金试纸条联合，在1对内引物中间设计1组探针，扩增产物直接用试纸条检测，使检测结果更直观、易于判定。

2 依赖解旋酶的等温扩增技术

2.1 原理

依赖解旋酶等温扩增技术(HDA)是由美国NEB公司研究人员Vincent M等在2004年建立的一种模拟生物体内DNA自然复制的扩增技术。HDA扩增过程可分为5个阶段：解旋酶解开DNA双链；单链DNA结合蛋白(single strand DNA-binding protein，SSB)结合其上得到完整的单链DNA；引物结合；聚合酶催化合成靶序列和解旋酶解新链再循环。反应初，在辅助蛋白的辅助下解旋酶与双链DNA结合，把双链DNA解成单链；体系中的SSB马上与产生的单链DNA结合，防止单链重新形成双链；同时引物与单链结合，在聚合酶的催化下合成靶序列。新合成的序列作为模板进入新一轮扩增，经过不断循环，目的片段呈指数增长[8-9]。其原理见图2。

图2 HDA的原理(Jeong Y J et al.2009)

2.2 优缺点

优点：HDA是一种真实模拟体内扩增的等温核酸扩增方法，且引物设计简单[10]。HDA依靠解旋酶、SSB和DNA聚合酶催化靶序列扩增，因此可以在恒温下进行，适于在基层实验室推广使用。

缺点：受解旋酶解旋速度的限制，HDA只能扩增短序列。虽然HDA扩增原理简单，但体系扩增步骤复杂，优化受限，尚未广泛用于病原检测和基因扩增。

2.3 发展与应用

为提高HDA反应效率，研究人员从细菌中提取到一种耐热的解旋酶(Tte-UvrD)，可在60℃～65℃扩增目的片段，体系不需添加DNA错配修复蛋白MutL和SSB。该方法已应用于痰液、胸膜液和尿液样品中结核分支杆菌的检测[11]，通过磁珠捕获扩增的DNA序列，进行扩增后杂交试验，以提高灵敏性和特异性。同时，还可以利用热稳定的HDA体系建立一种检测RNA片段的扩增方法[12]。

另外，通过对T7噬菌体复制机制的研究，在最初反应体系的基础上又建立了一种高效快速的HDA检测方法，称为环状HDA体系(circular HDA system,cHDA)。T7噬菌体复制系统可以扩增环形DNA和长达10 kb的目的片段[13]。Schwenkbier L等[14]成功将磁珠法提取植物DNA、HDA和DNA芯片杂交技术相结合，建立了一种植物疫霉的现场快速检测方法，最低检测限可达10 pg/μL。

3 依赖核酸序列的等温扩增技术

3.1 原理

依赖核酸序列等温扩增(NASBA)是一种由Compton J报道的可对RNA序列进行扩增的新技术[15]。反应体系包括AMV逆转录酶、噬菌体T7 RNA聚合酶、RNase H和2种特别设计的特异性引物等。RNA模板链进入反应体系后，含有T7启动子的引物P1先与模板链3′端结合，在逆转录酶作用下合成互补链，然后RNase H降解与DNA杂交结合的RNA链，随后引物P2与单链DNA的3′端结合并延伸，最后依赖于DNA的T7 RNA聚合酶通过识别双链DNA上的T7启动子合成大量RNA补偿链，反应循环进行。NASBA还可用于DNA的扩增，即在扩增前将DNA加热变性，再依原理加入相应的酶进行反应，扩增产物仍然是RNA[16]。其原理见图3。

图3 NASBA的原理(Gao S D et al.2009)

3.2 优缺点

优点：NASBA在42℃即可进行大量扩增。因反应产物是单链RNA，不易造成交叉污染而出现假阳性，同时还能通过杂交检测系统进一步提高检测的敏感性和特异性，是一种适合检测RNA序列的扩增技术[17]。

缺点：反应成分复杂，成本高，需要3种酶共同作用完成扩增。

3.3 发展与应用

基于NASBA的一系列优点，该技术已应用于病毒、细菌和寄生虫等研究中。植物细胞壁中含有大量多糖、酚类物质，提取植物病毒RNA也存在着稳定性差和效率低等问题，而RNA本身容易降解，导致最终提取的RNA病毒含量较低，对检测方法的灵敏度和稳定性要求较高。而NASBA技术将反转录和扩增反应一步完成，适合各种RNA样品的分析。因此,NASBA技术与分子信标结合建立了草莓镶脉病毒(Strawberry vein banding virus，SVBV)的检测方法，其灵敏度可达1 ng[18]。

侵袭性曲霉菌(Invasive aspergillosis，IA)可危及免疫受损患者的生命，因此对早期感染患者快速、灵敏的检测至关重要。Du L等[19]建立了检测曲霉菌的NASBA-ELISA方法以满足需要。在高度保守的18 S rRNA区域特异位点处设计引物，并标记地高辛(digoxigenin，DIG)，DIG标记的RNA扩增产物与固定在链霉亲和素包被的微量滴定板上的特异性生物素化DNA探针杂交，通过加入与ALP和底物(磷酸4-硝基苯酯二钠)连接的抗DIG抗体来比色检测杂交体。NABSA-ELISA方法的检测限为1 CFU，与其他细菌和真菌无交叉反应。与RT-PCR和半乳甘露聚糖(galactomannan，GM)相比，NASBA-ELISA、RT-PCR和GM-ELISA的灵敏度分别为80.56%、72.22%、58.33%，特异性为80.00%、84.00%、82.00%。总之，NASBA与ELISA结合，可用于大规模样品检测并有半定量结果，具有很好的参考价值。

4 链置换等温扩增技术

4.1 原理

Walker G T等[20]于1992年报道了关于链置换扩增(SDA)的研究，标志着一种新的核酸等温扩增技术的诞生。反应体系包括限制性核酸内切酶、链置换DNA聚合酶、两对引物等。反应包括3个阶段：①引物与DNA单链上对应的靶DNA序列结合，使靶DNA两端带上被化学修饰的限制性核酸内切酶识别序列；②核酸内切酶在其识别位点将DNA链打开缺口，DNA聚合酶在缺口处向3′端延伸并置换出DNA单链；③被替换下来的DNA单链可分别与引物结合并延伸形成双链。在37℃条件下反复循环2 h，扩增靶序列的拷贝数可达108。其原理见图4。

图4 SDA的原理(Walker G T et al.1992)

4.2 优缺点

优点：链置换依靠具有链置换活性的DNA聚合酶进行循环扩增，基于此，其他等温扩增技术相继出现，使核酸扩增方法效率更高、更快速简便。

缺点：SDA必须使用修饰过的dNTP，不能完成长片段的扩增；在建立缺口时要加入非标准核苷酸，因此成本增加的同时扩增效率却降低；SDA产物两端还残留着核酸内切酶的识别序列，不能用于克隆。

4.3 发展与应用

SDA在疾病和基因诊断等方面已有报道。为了弥补其缺点，邓世琼等[21]将缺口酶Nt.Bst- NBI代替限制性内切酶，通过体系优化建立了一种低成本的新型检测方法，可在30 min内检测到2 pmol/L的质粒DNA，具有很好的应用前景。

马雯[22]将SDA与电化学传感技术联用构建核酸多酶标记体系，建立了一种高效、快速的miRNA检测方法。利用磁性纳米颗粒作为液相检测的微载体，将探针连接至微载体后体系中的miRNA与微载体上的探针结合，可将引物与聚合酶连接到探针上进行延伸并进入循环扩增。扩增结束后，加入链霉亲和素标记的碱性磷酸酶(streptavidin-alkaline phosphatase，Sa-ALP)通过磁性分离，可在磁性颗粒上标记大量酶而产生酶促产物抗坏血酸，经电极氧化为脱氢抗坏血酸，最终检测产生的氧化峰电流。该方法检测限为9 fM，与荧光定量PCR结果一致。

针对SDA必须使用修饰过的dNTP的问题，优思达公司研发出一种切刻内切酶等温扩增技术(nicking enzyme mediated isothermal amplification，NEMA)，将限制性内切酶用嗜热切刻内切酶替换，该方法不但减少成本，还能扩增长片段。王纪东等[23]已建立了检测蜡样芽胞杆菌质粒的NEMA技术，得到450 bp的扩增产物。目前，已经开发出NEMA试剂盒并获得专利。

5 交叉引物等温扩增技术

5.1 原理

交叉引物扩增技术(CPA)是杭州优思达生物公司新研发的一种等温扩增技术，中国首个具有自主知识产权的核酸扩增技术[24]。根据交叉引物数量的不同，CPA可分为双交叉扩增和单交叉扩增。

双交叉引物扩增包括3对引物(两条交叉引物、两条剥离引物和两条探针)、Bst DNA聚合酶、甜菜碱及其他必要成分。正向交叉引物中的1s与模板互补序列结合，在链置换DNA聚合酶的作用下完成延伸，剥离引物3s将合成的DNA单链置换下来，反向交叉引物2a与其结合并延伸，经剥离引物4a置换，即可产生带有交叉引物位点的扩增产物。以带有交叉引物位点的扩增产物为模板，通过交叉引物和DNA聚合酶的循环杂交、延伸，就可得到大量重复带有交叉位点的扩增产物。其原理见图5。

单交叉引物扩增体系中只有一条交叉引物，首先交叉引物中的1s与模板互补序列结合延伸，剥离引物4s置换出新合成的单链，将2a引入到扩增产物中，在链置换DNA聚合酶作用下，以新合成的单链为模板，引入特异引物3a、2a，得到两条不同的单链DNA。2a和交叉引物分别与单链DNA产物迅速结合并延伸，形成两条不同长度的产物。以此产物为模板，引物1s或3a、2a与其结合、延伸，不断循环杂交，最终得到大量扩增产物。其原理见图6。

a．引物设计位点；b．带有交叉引物位点扩增模板的产生 a．Primer design site；b．Generation of the template with cross-priming site

a．引物设计位点；b．带有引物位点模板的产生 a．Primer design site；b．Generation of the template with primer site

5.2 优缺点

优点：操作简单，在水浴锅内63℃左右条件下1 h即可得到大量产物，结合胶体金试纸条技术可快速得到检测结果。

缺点：反应体系复杂，方法不稳定，有假阳性现象[25]。

5.3 发展与应用

为解决开盖检测带来的污染，尤思达公司发明了一次性核酸检测装置，并相继研发了多种检测试剂盒。赵婷婷等已成功建立了炭疽芽胞杆菌的CPA检测方法，其灵敏度可达5.4 pg，对炭疽Sterne疫苗株的检测限为6×103CFU/mL，与其他相似菌株均无交叉反应[26]。表明建立的方法特异性好、灵敏度高，可应用于国境检疫及公共卫生安全领域。

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)是一种高度传播的冠状病毒，可引起仔猪尤其是新生仔猪严重的肠道疾病。Wang F X等开发了快速检测PEDV的CPA-NATS方法，针对PEDV的N基因序列特异设计5条引物，其中两个特异引物5′端分别连接生物素和FITC，可与胶体金试纸条上的相应抗体结合，根据试纸条检测线和质控线处有无条带判定扩增结果。结果表明，该方法对PEDV的检测特异性高，虽然检测限与PCR一致，但用时少，不需要复杂的仪器，为现场快速准确诊断该病提供了很好的解决方法[27]。

6 应用前景及展望

诊断检测方法的建立，最终目的均是应用到实际检测中去。等温扩增技术无需复杂的仪器，不需要热变性与温度循环，同时具有简便、快速、灵敏度高、特异性强等优点，因此被寄予厚望。然而，等温扩增技术作为一种新兴技术仍具有很大的改进空间。首先，LAMP、CPA、SDA和NASBA方法涉及到引物较多和引物设计要求较高等问题，从而限制了其在病原检测中的应用。其次，等温扩增产物多为同一片段形成的多拷贝长链，反应体系中即使只含有一条因气溶胶污染而存在的扩增产物，其扩增的目的片段浓度也提高了几十倍甚至几千倍，因此该方法极易产生假阳性。针对这一问题，Hsieh K等[28]在反应体系中加入dUTP，将扩增产物的胸腺嘧啶替换为尿嘧啶，同时加入的尿嘧啶-DNA-糖基化酶(uracil-DNA-glycosylase，UDG)通过特异性地降解尿嘧啶来消除污染。另外，杭州尤思达生物公司研制了一次性检测装置，等温扩增反应阶段及检测阶段均在密闭的检测装置内进行，避免开盖带来的污染，有效解决了气溶胶带来的污染问题[29]。

目前，等温扩增技术如何与可视化生物传感器相结合并进行高通量的现地检测成为当前研究的热点。微流控芯片技术通过与等温扩增技术相结合，仅在一个芯片上即可完成核酸提取、扩增和检测等过程，具有快速、简便、结果直观和可进行高通量筛选等优点[30]。随着相应的便携式装置的开发及费用的降低，等温扩增-微流控芯片技术必将成为下一代基因快速检测的发展方向。

综上所述，等温扩增技术以其操作简便、省时省力和不需要昂贵仪器的特性逐渐得到广泛应用，随着对它们的不断完善，一定会成为在生物学、医学和兽医学领域中广泛应用的检测方法。

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Abstract:Isothermal amplification technology is a new type of nucleic acid amplificationinvitrothat grows rapidly in recent years.Compared with traditional PCR,this technology takes advantages such as low cost,easy-to-operate,higher sensitivity and specificity.Many isothermal amplification technologies are applied to the detection of bacteria,viruses and other pathogens.Here the principle,feature and application of isothermal amplification technologies are reviewed including loop-mediated isothermal amplification (LAMP),helicase-dependent isothermal amplification (HDA),nucleic acid sequence-based amplification (NASBA),strand displacement amplification (SDA),and cross priming amplification (CPA).It provides a reference for the practical applications in the detection of pathogens.

Keywords:isothermal amplification technology; principle; pathogen detection

ApplicationofIsothermalAmplificationTechnologyinDetectingPathogens

GAO Yao1,2,MENG Xing-yu1,LUO Yu-zi1,HU Yong-hao2,QIU Hua-ji1

(1.StateKeyLaboratoryofVeterinaryBiotechnology,HarbinVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Harbin,Heilongjiang,150069,China; 2.CollegeofVeterinaryMedicine,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou,Gansu,730070,China)

S854.4

1007-5038(2017)08-0103-07

2017-02-09

国家重点研发计划畜禽重大疫病防控与高效安全养殖综合技术研发专项(2016YFD0500705)

高瑶(1991- )，女，河南鹤壁人，硕士研究生，主要从事动物传染病分子诊断技术研发。*