外周血MYH7、TNNI3基因突变与家族性肥厚型心肌病发病的关系

陈培，闫继锋

(1郑州大学第五附属医院，郑州450052；2河南省胸科医院)

外周血MYH7、TNNI3基因突变与家族性肥厚型心肌病发病的关系

陈培1，闫继锋2

(1郑州大学第五附属医院，郑州450052；2河南省胸科医院)

目的观察1个中国汉族肥厚型心肌病(HCM)家系的基因突变类型，并探讨其对临床表型的影响。方法选择1个中国汉族HCM家系，家系成员共13例，其中5例确诊为HCM。采用新一代高通量测序技术检测先证者外周血44个心肌病靶基因，结果显示其存在β肌球蛋白重链7(MYH7)基因18号外显子Arg663His突变及肌钙蛋白I3(TNNI3)基因7号外显子c.470C>T突变。采用双脱氧末端终止法测序检测该家系中其他成员上述两个基因的突变情况，分析不同MYH7、TNNI3基因突变的HCM患者的临床表现。结果先证者与其妹妹均存在MYH7基因18号外显子Arg663His及TNNI3基因7号外显子c.470C>T双突变，HCM发病年龄分别为2、1岁；心电图均示异常Q波，ST-T改变，左室高电压；超声心动图均示左房增大，室间隔中段以上最厚处分别为25、23 mm，SAM征阳性，左室流出道压差分别为80、68 mmHg。先证者的母亲、二舅及外公仅MYH7基因18号外显子Arg663His突变，HCM发病年龄分别为21、19、30岁；心电图均示ST-T改变，左室高电压；超声心动图均示室间隔增厚，最厚处分别为16、18、18 mm，SAM征阴性，无左室流出道梗阻。先证者表弟仅MYH7基因18号外显子Arg663His突变，临床无明显症状，心电图及超声心动图检查无异常。结论该汉族HCM家系TNNI3基因发生从头突变，MYH7基因突变由遗传而来；MYH7与TNNI3基因双突变者HCM发病时间早、临床症状严重、预后较差。

肥厚型心肌病；β肌球蛋白重链7；肌钙蛋白I3；基因突变；遗传性心脏病；汉族

Abstract:ObjectiveTo observe the gene mutation types in a Chinese Han hypertrophic cardiomyopathy (HCM) family and to explore its effect on clinical phenotype.MethodsWe selected 1 Chinese Han HCM family, including 13 family members, among whom 5 were diagnosed as HCM. New generation of high-throughput sequencing technology (NGS) was used to sequence the 44 genes of the target genomes associated with human cardiomyopathy of the proband. The results indicated that the proband carried β-myosin heavy chain (MYH7) gene Arg663His in exon 18 and troponin I (TNNI3) gene c.470C>T in exon 7. The mutations of the two genes in other members of the family were detected by the dideoxy chain-termination method, and the clinical manifestations of HCM patients with MYH7 and TNNI3 gene mutations were analyzed.ResultsThe proband and his sister carried MYH7 gene exon 18 Arg663His mutation and TNNI3 gene exon 7 c.470C> T mutation, and the age of onset was respectively 2 and 1 years old. The ECG showed abnormal Q wave, ST-T changes, and left ventricular high voltage. Echocardiography showed left atrium enlargement, the thickest part of interventricular septum was 25 and 23 mm, SAM was positive, and the left ventricular outflow pressure were 80 and 68 mmHg, respectively. The proband's mother, uncle and grandfather carried Arg663His mutation in MYH7 gene exon 18, and the age of onset was 21, 19, and 30 years old, respectively. The ECG showed ST-T changes and left ventricular high voltage. Echocardiography showed that the thickest part of interventricular septum were 16, 18, and 18 mm, respectively, SAM were negative, and no left ventricular outflow tract obstruction. The proband′s cousin only carried Arg663His mutation in MYH7 gene exon 18. There were no obvious clinical symptoms, and no abnormalities in ECG and echocardiogram.ConclusionsThe TNNI3 gene in the HCM family underwent de novo mutation, and the MYH7 gene mutation was inherited. The patients with double mutations of MYH7 and TNNI3 gene presented a younger onset age, severe clinical phenotype and poor prognosis.

Keywords: hypertrophic cardiomyopathy; β-myosin heavy chain-7; troponin 13; gene mutation; inherited heart disease; Han nationality

肥厚型心肌病(HCM)是最常见的遗传性心脏病，发病率约为1/500，男女性发病率相同[1]。HCM临床表现可为心源性猝死、晕厥、进行性心衰，也可表现为轻到中度症状甚至无临床症状，被认为是年轻人和竞技性运动员猝死的最主要原因[5]。HCM呈常染色体显性遗传模式，多为家族性发病，在不同的家族间和同一家族内存在广泛的临床异质性[2]。过去二十年，在至少21个HCM相关基因中有超过1 500种致病性突变被确认[3]，这些突变大部分(约87%)为单核苷酸替换，小部分(约13%)为小片段的插入或缺失突变[4]。国内对HCM致病基因的研究多局限于数个编码肌小节的基因，必然会导致致病基因的检出率降低，使一部分携带其他致病基因的HCM患者不能筛查出致病基因，对其家系成员的筛查及遗传学研究也就无从谈起。本研究全面筛查1个HCM家系先证者的心肌病靶基因，并在此基础上进行该家系其他成员致病基因检测，分析基因突变与临床表型的关系。

1 临床资料

1.1 基本资料 选择2012～2016年就诊于河南省胸科医院的1个中国汉族HCM家系，家系成员共13例(家系成员分布见图1)，男7例、女6例，年龄3～66岁。13例家庭成员中确诊为HCM 5例，均符合2014年欧洲心脏病学会(ESC)诊断与治疗指南中的HCM诊断标准：对于成年人，心脏影像学技术(包括超声心动图、CT影像学技术、心脏磁共振成像)测得左心室某一阶段或多个阶段室壁厚度≥15 mm，可确诊为HCM；对于儿童，左心室厚度≥预测平均值+2倍标准差(即Z值>2，Z值为所测数值偏离平均值的标准差)，可确诊为HCM；对于HCM患者的一级亲属，若心脏影像学技术检测发现无其他已知原因的左心室室壁某一阶段或多个阶段厚度≥13 mm，可确诊为HCM[6]。排除其他引起左心室负荷增高的系统性疾病，如长期难以控制的高血压、主动脉瓣狭窄等。本研究通过河南省胸科医院伦理委员会批准，受试者均签署知情同意书。

1.2 先证者44个心肌病靶基因突变筛查情况 采用新一代高通量测序技术。方法如下：①基因组DNA抽提：抽取先证者外周静脉血5 mL，依地酸二钠(EDTA)抗凝，采用基因组提取试剂盒(广州燃石医学检验所有限公司)提取先证者的基因组DNA，Nanodrop2000样本定量检测仪和琼脂糖凝胶电泳进行质控。②DNA全基因文库制备：每份样本取2 μg DNA，稀释后使用Bioruptor超声仪进行片段化，大小约为200 bp。采用NEB Next DNA文库制备试剂盒(美国NEB公司)制备全基因组文库，PCR扩增10个循环后，将产物采用AMPPure磁珠(美国Beckman公司)进行纯化。③目标基因捕获：44个心肌病靶基因包括α-心肌肌动蛋白1(ACTC1)基因、骨形态生成蛋白受体2(BMPR2)基因、小窝蛋白3(CAV3)基因、α-半乳糖苷酶(GLA)基因、溶酶体关联膜蛋白2(LAMP2)基因、肌球蛋白结合蛋白C3(MYBPC3)基因、β肌球蛋白重链7(MYH7)基因、肌球蛋白调节轻链2(MYL2)基因、肌球蛋白轻链3(MYL3)基因、苷单磷酸活化蛋白激酶γ2(PRKAG2)基因、肌钙蛋白C1(TNNC1)基因、肌钙蛋白I3(TNNI3)基因、肌钙蛋白T2(TNNT2)基因、α-原肌球蛋白1(TPM1)基因、运甲状腺素蛋白(TTR)基因、SUR2蛋白(ABCC9)基因、α-肌动蛋白2(ACTN2)基因、结蛋白(DES)基因、α-粘连蛋白4(LAMA4)基因、LIM结构域结合蛋白3(LDB3)基因、核纤层蛋白A/C(LMNA)基因、β肌球蛋白重链6(MYH6)基因、Myopalladin(MYPN)基因、受磷蛋白(PLN)基因、早老素1(PSEN1)基因、早老素2(PSEN2)基因、RNA-binding motif 蛋白20(RBM20)基因、电压门控钠通道α亚基(SCN5A)基因、δ-肌聚糖(SGCD)基因、taffzzins 蛋白(TAZ/G4.5)基因、T帽蛋白(TCAP)基因、促胸腺生成素(TMPO)基因、黏着斑蛋白(VCL)基因，以及线粒体蛋白(MTTD、MTTH、MTTL1、MTTL2、MTTM、MTTS1、MTTS2、MTTG、MTTI、MTTK、MTIQ)基因。将包含上述44个靶基因的捕获探针(美国Oto公司)与先证者的全基因文库混合，富集目标区域基因组片段，洗脱非目标区域片段，使用Agilent2000(美国Agilent Technologies公司)生物分析仪检测文库片段大小，Illumina-SolexaHiSeq2000(美国Illumina公司)进行测序。④生物信息学分析：通过检索GATK项目(http//www.broadinstitute.org/gsa/wiki/index.php/Home_Page)以及1000Genomes(http：//www.1000genomes.org)，确认基因突变在人群中的频率。通过PolyPhen-HCM(http：//genetics.bwh.harvard.edu/hcm)确定基因突变的致病性。结果显示，先证者存在MYH7基因18号外显子Arg663His突变及TNNI3基因7号外显子c.470C>T突变。

注：□为正常男性；○为正常女性；■为HCM男性患者；●为HCM女性患者；为先证者。

图1该HCM家系成员分布情况

1.3 家系其他成员MYH7基因18号外显子及TNNI3基因7号外显子突变情况 采用双脱氧末端终止法测序检测。提取其余家系成员基因组DNA，聚合酶链反应(PCR)扩增家系其他成员MYH7基因18号外显子及TNNI3基因7号外显子，对产物进行纯化，双脱氧末端终止法进行测序。结果显示，Ⅲc存在MYH7基因18号外显子Arg663His及TNNI3基因7号外显子c.470C>T双突变，Ⅰa、Ⅱc、Ⅱe、Ⅲe存在 MYH7 基因18号外显子Arg663His突变，其余家系成员未见上述两种基因突变。

1.4 不同MYH7、TNNI3基因突变的HCM患者表型分析 收集5例HCM患者及Ⅲe的临床资料，包括性别、年龄、HCM发病年龄、主要症状、体征及心电图、超声心动图检查结果，分析MYH7、TNNI3基因突变对HCM表型的影响。结果显示：①Ⅲb(先证者)，男，5岁， MYH7基因18号外显子Arg663His及TNNI3基因7号外显子c.470C>T双突变。HCM发病年龄2岁，体检发现心脏杂音，超声心动图检查室间隔厚22 mm，3岁时奔跑过程中发生晕厥，此后多次于活动时发生晕厥，心脏听诊心前区可闻及3/6级吹风样杂音。心电图示异常Q波(Ⅰ、aVL、V4～V6导联Q波窄而深)，ST-T改变，左室高电压。超声心动图示左心房增大，室间隔及左室后壁增厚，以室间隔中段以上增厚为主，最厚处25 mm，SAM征阳性(完全性)，左室流出道压差80 mmHg。②Ⅲc(先证者妹妹)，女，3岁，MYH7基因18号外显子Arg663His及TNNI3基因7号外显子c.470C>T双突变。HCM发病年龄1岁，体检发现心脏杂音，2岁后活动时多次发生晕厥，心脏听诊心前区可闻及3/6级吹风样杂音。心电图示异常Q波(V4～V6导联Q波窄而深)，ST-T改变，左室高电压。超声心动图示左心房增大，室间隔及左室后壁增厚，以室间隔中段以上增厚为主，最厚处23 mm，SAM征阳性，左室流出道压差68 mmHg。③Ⅱc(先证者母亲)，女，30岁，仅MYH7基因18号外显子Arg663His突变。HCM发病年龄21岁，活动后出现心悸、胸痛，无黑曚、晕厥等。心电图示ST-T改变，左室高电压。超声心动图示室间隔增厚，最厚处16 mm，SAM征阴性，无左室流出道梗阻。④Ⅱe(先证者二舅)，男，28岁，仅MYH7基因18号外显子Arg663His突变。HCM发病年龄19岁，活动后出现心悸、胸痛，无黑曚、晕厥。心电图示ST-T改变，左室高电压。超声心动图示室间隔增厚，最厚处18 mm，SAM征阴性，无左室流出道梗阻。⑤Ⅰa(先证者外公)，男，66岁，仅MYH7基因18号外显子Arg663His突变。HCM发病年龄30岁，活动后呼吸困难，心悸、胸痛，无晕厥。心电图示房颤心律，完全性左束支传导阻滞，ST-T改变，左室高电压。超声心动图示室间隔增厚，最厚处为18 mm，SAM征阴性，无左室流出道梗阻。⑥Ⅲe(先证者表弟)，男，3岁，仅MYH7基因18号外显子Arg663His突变。无明显临床症状，心电图及超声心动图检查无异常。

2 讨论

随着新一代高通量测序技术的发展，越来越多的HCM患者被发现存在双基因突变。国外曾报道，HCM患者双基因突变率为5%～10%，并与发病年龄提前有关[5～7]。Kubo等[8]对1个日本家系进行研究发现，先证者存在肌球蛋白结合蛋白基因p106fs突变及MYH7基因R869C突变，较家系内其他单基因突变者发病更早，室间隔更厚，左室流出道梗阻更严重，与本研究中家系临床特点相似。赵蓓等[9]研究发现，MYBPC3基因c.2526C>G及c.2791G>A双基因突变可能导致心肌肥厚范围扩大，心肌受损程度加重，左室舒张功能受损。Marziliano等[10]报道了1例MYBPC3基因p.Glu258Lys错义突变及IVS25-1G>A剪切位点突变婴儿，该突变致婴儿双心室肥厚、心房扩大，并在出生30天死亡。Maron等[11]研究表明，HCM患者的基因双突变可能会导致一种剂量累积效应，使病变的恶性程度加重，猝死风险性增高。本研究13例HCM家族成员中Ⅲb、Ⅲc存在MYH7基因18号外显子Arg663His及TNNI3基因7号外显子c.470C>T双突变，在国内尚属首次报道。

HCM患者MYH7突变率为35%～40%，MYH7是最常见的HCM致病基因之一。MYH7基因编码的MYH7蛋白，是心脏肌小节粗肌丝的重要组成部分。MYH7基因长23 kb，共有41个外显子，编码一个由1 935个氨基酸组成的蛋白质。目前发现与MYH7基因相关的突变超过490个，MYH7基因突变绝大多数为错义突变，少部分为缺失和插入突变，突变主要发生于肌球蛋白头部的四个区，尚有一小部分发生于肌球蛋白杆部[12]。TNNI3为细肌丝的重要组成部分，与肌钙蛋白C、肌钙蛋白T共同构成肌钙蛋白复合体。TNNI3仅在心肌组织中表达，长6.2 kb，有8个外显子，编码1个210个氨基酸的蛋白；HCM患者MYH7突变率约为35%，目前发现TNNI3基因突变超过70个[12]。Zheng等[13]发现1个HCM家系携带TNNI3基因4号外显子(c.235C>T)及6号外显子(c.470C>T)的双杂合突变，认为该突变因单倍型不足而致病。施鑫等[14]报道了HCM患者TNNI3基因7号外显子(c.470C>T)突变，该类患者晚期存在心脏变薄、心腔扩张的情况。本研究家系中未发现相似情况，说明该突变在HCM患者中存在异质性。王曙霞等[15]报道了HCM患者TNNI3基因7号外显子143位突变，导致精氨酸变为色氨酸，临床表现以心尖肥厚为主，临床症状轻微。

本研究该家系中仅Ⅲb、Ⅲc存在MYH7基因18号外显子Arg663His及TNNI3基因7号外显子c.470C>T双突变，而Ⅰa、Ⅱc、Ⅱe仅存在MYH7基因18号外显子Arg663His突变；说明MYH7基因突变为遗传而来，而TNNI3基因在该家系中为从头突变。本家系成员中，仅存在MYH7基因18号外显子Arg663His突变的Ⅰa、Ⅱc、Ⅱe临床表现主要为活动后胸闷、胸痛、心悸等，症状相对较轻；与宋雷、刘文玲等[16,17]研究结果一致。本家系中上述两个基因突变都导致了临床表型，双基因突变者发病年龄早，心肌肥厚程度重，流出道梗阻重，活动后晕厥反复发作。因此，双基因突变可能是导致该家系成员具有不同表型的原因之一。值得注意的是，Ⅲe与先证者年龄相仿，但仅存在MYH7基因18号外显子Arg633His突变，也未表现出心肌肥厚及其他临床症状。因此，我们认为TNNII3基因突变在先证者及其妹妹的临床表型中起主要作用。

综上所述，该HCM家系TNNI3基因发生从头突变，MYH7基因突变由遗传而来；MYH7与TNNI3基因双突变者发病时间早、临床症状严重、预后较差。针对MYH7与TNNI3基因双突变的HCM患者，临床上需要采取更积极的治疗措施，如室间隔减容术及埋藏式心律转复除颤器植入等。

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Relationships of MYH7 and TNNI3 mutations with familial hypertrophic cardiomyopathy

CHENPei1,YANJifeng

(1TheFifthHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

河南省医学科技攻关计划项目(201002022)。

陈培(1984-)，男，硕士研究生在读，研究方向为肥厚型心肌病的基础与临床。E-mail： 15890138320@163.com

闫继锋(1966-)，男，教授，研究方向为冠心病、先心病及心律失常的诊断和介入治疗。E-mail： jfyan66@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.32.008

R542.2

A

1002-266X(2017)32-0029-04

2016-11-10)