痛泻要方对肝郁脾虚型溃疡性结肠炎大鼠结肠组织中gp130、SOCS3表达的影响

杨意，朱向东，翟艳会，李婷

(甘肃中医药大学，兰州730000)

痛泻要方对肝郁脾虚型溃疡性结肠炎大鼠结肠组织中gp130、SOCS3表达的影响

杨意，朱向东，翟艳会，李婷

(甘肃中医药大学，兰州730000)

目的观察痛泻要方对肝郁脾虚型溃疡性结肠炎(UC)模型大鼠结肠组织中糖蛋白130(gp130)、细胞因子信号传导抑制蛋白3(SOCS3)基因和蛋白表达的影响。方法将60只大鼠随机分为A、B、C、D组各15只，B、C、D组均采用三硝基苯磺酸/乙醇溶液+束缚应激、饮食失节法行肝郁脾虚型UC造模，A组采用同样方法用等量的生理盐水灌肠。C、D组分别予以痛泻要方 (生药5.5 g/kg)、美沙拉秦(0.5 g/kg)灌胃10 mL/kg，A、B组灌服等体积生理盐水。各组造模成功后第1天开始灌胃，1次/d，连续21 d。取出距肛门以上7～8 cm处结肠段，肉眼行结肠黏膜损伤评分，分别采用Real-time荧光定量PCR法及免疫组化、免疫印迹法检测结肠组织中的gp130、SOCS3基因和蛋白。结果B组结肠黏膜损伤评分为(2.67±0.62) 分，高于A组的(0.6±0.63)分(P<0.01)；C、D组分别为(1.73±0.70)、(1.27±0.46)分，均高于B组(P均<0.01)；C、D组间比较无统计学差异。B组较A组结肠组织中gp130基因和蛋白表达升高、SOCS3基因和蛋白表达降低(P均<0.05)，C、D组较B组结肠组织中gp130基因和蛋白表达降低、SOCS3基因和蛋白表达升高(P均<0.05)，C、D组结肠组织gp130、SOCS3基因和蛋白比较无统计学差异。结论痛泻要方可下调gp130表达、上调SOCS3表达，从而有效降低肝郁脾虚型UC大鼠结肠黏膜损伤程度。

溃疡性结肠炎；痛泻要方；美沙拉秦；糖蛋白130；细胞因子信号传导抑制蛋白3；大鼠

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级Wistar大鼠60只，体质量(180±10)g，雌雄各半，由甘肃中医学院科研实验动物中心提供。

1.1.2 实验试剂 三硝基苯磺酸(TNBS，Sigma公司)；美沙拉秦缓释颗粒剂(5-ASA，爱的发制药公司)。痛泻要方(惠仁堂大药房，由甘肃中医药大学药剂科鉴定为真品)。TRIzol试剂(美国 Invitrogen 公司)；反转录试剂盒、PCR试剂盒、扩增试剂盒(Promega 公司)。浓缩型DAB底物液、DAB溶液、兔SP试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；SDS-PAGE凝胶试剂盒(Solarbio公司)；gp130一抗、SOCS3一抗(Abcam公司)。

1.1.3 仪器与设备 Biorad iMark酶标仪、CFX96 Real-time荧光定量PCR仪(BIO-RAD公司)；通用台式高速离心机(Sigma3-16PK型)；立式超低温冰箱(海尔DM-86L626型)；凝胶成像仪、电泳仪(BIO-RAD公司)等。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组与造模 将60只大鼠随机分为A、B、C、D组各15只，B、C、D组均采用TNBS/乙醇溶液+束缚应激、饮食失节法行肝郁脾虚型UC造模[3]。具体方法：每日不定时限制其自由活动，每次限制时间约为6 h；隔日给予饲料，模拟饥饱失常。束缚1周后，所有动物禁食(不禁水)24 h；腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉后，一次性将TNBS/乙醇溶液(100 mg/kg TNBS+50 %乙醇溶液0.25 mL)灌入直肠。灌肠造模后每日仍然持续束缚大鼠四肢，隔日进食，连续2周。A组采用同样方法用等量的生理盐水灌肠。

1.2.2 给药处理与标本获取 C、D组分别予以痛泻要方 (生药5.5 g/kg，按照临床成人用量的10倍折算)、美沙拉秦(0.5 g/kg)灌胃10 mL/kg，A、B组灌服等体积生理盐水。各组造模成功后第1天开始灌胃，1次/d，连续21 d。取出距肛门以上7～8 cm处结肠段，沿肠系膜缘剪开肠腔，用4 ℃生理盐水冲洗肠内容物。取病变处结肠 5 cm，生理盐水冲洗,观察结肠黏膜损伤情况,置-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 结肠黏膜损伤情况观察 肉眼观察大鼠结肠大体形态, 结肠黏膜损伤评分标准参考文献[4]。

1.2.4 结肠黏膜组织中gp130、SOCS3基因检测 采用Real-time荧光定量PCR法。提取RNA，逆转录合成cDNA。gp130上游引物5′-CCCTGAGTTTCCAGTTGTCC-3′，下游引物5′-ATGGTTTGTCTTCCACACGA-3′；SOCS3上游引物5′-TCACCCACAGCAAGTTTCC-3′，5′-TCCAGTAGAATCCGCTCTCC-3′；内参β-actin上游 引物5′-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3′，下游引物5′-AAGGGTGTAAAACGCAGCTC-3′。引物由上海生工生物工程公司设计提供。反应体系(20 μL)：Go Taq-qPCR Master Mix 10 μL、 上游引物1 μL、下游引物1 μL、cDNA 2 μL、CXR Reference Dye 0.2 μL、 Nuclease-free Water 5.8 μL。反应条件：95 ℃预变性2 min； 95 ℃ 15 s，60℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 个循环； 65 ℃退火5 s(gp130)/95 ℃退火15 s(SOCS3)。取各组Ct值，ΔCt =目的基因Ct值-β-actin Ct值，2-ΔΔCt法计算相对定量，每个样本均重复3孔后取均值。

这是商景兰对于自我价值的理解和思考，是女性觉醒的可贵声音。以“才”为归结点，商景兰把现世幸福的失落，在“立言”以求不朽中得到了超越，从而将文学活动作为生命苦难的感性慰藉，升华到扬名后世的理性追求。商景兰后半生的生命探索与价值追寻，至此划上了圆满的句号。

1.2.5 结肠黏膜组织中gp130、SOCS3蛋白检测 ①免疫组化法：采用经典SABC法。主要步骤：将固定好的石蜡切片常规二甲苯脱蜡，滴加3% H2O2孵育10 min，PBS冲洗；将切片浸入0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0)中煮沸，进行抗原修复；待自然冷却，滴加5%BSA封闭，室温20 min。加入gp130、SOCS3一抗，每组设PBS作为阴性对照，4 ℃冰箱过夜。滴加生物素标记二抗，在37 ℃培养箱中孵育20 min。滴加试剂SABC，在37 ℃培养箱中孵育20 min。DAB显色剂染色，苏木素轻度复染3 min；脱水、透明、干燥，中性树胶封片。在显微镜下观察结果并摄片，运用医学数码图像分析系统，测量每张平片gp130、SOCS3阳性细胞的平均光密度。②免疫印迹法：先提取组织蛋白，以BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度；Buffer(5×)进行蛋白变性、电泳，转膜。封闭后分别用GAPDH(1∶2 000，33 kD)、gp130(1∶500，103 kD)、SOCS3(1∶500，30 kD)一抗孵育16 h，加入二抗孵育2 h。化学发光法显影，分析凝胶成像图片，以目的蛋白与GAPDH光密度比值作为目的蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 各组结肠大体形态及结肠黏膜损伤评分比较 A组大鼠肠道不增厚，无粘连，肠皱襞纹理清晰，肠黏膜光滑，未见明显的充血水肿、糜烂及溃疡；B组大鼠病变结肠明显可见黏膜充血、水肿,有不同程度的糜烂及溃疡形成,肠壁增厚、粘连，肠道短缩；C、D组结肠黏膜损伤情况均得到一定改善,表现为少量充血、水肿。B组结肠黏膜损伤评分为(2.67±0.62) 分，高于A组的(0.6±0.63)分(P<0.01)；C、D组分别为(1.73±0.70)、(1.27±0.46)分，均高于B组(P均<0.01)；C、D组间比较无统计学差异。

2.2 各组结肠组织gp130、SOCS3基因表达比较 B组较A组结肠组织中gp130基因表达升高、SOCS3基因表达降低(P均<0.05)，C、D组较B组结肠组织中gp130基因表达降低、SOCS3基因表达升高(P均<0.05)，C、D组结肠组织gp130、SOCS3基因比较无统计学差异。见表1。

表1 各组结肠组织gp130、SOCS3基因表达比较

注：与A组比较,*P<0.05；与B组比较,#P<0.05。

2.3 各组大鼠结肠组织gp130、SOCS3蛋白表达比较 B组较A组结肠组织中gp130蛋白表达升高、SOCS3蛋白表达降低(P均<0.05)，C、D组较B组结肠组织中gp130蛋白表达降低、SOCS3蛋白表达升高(P均<0.05)，C、D组结肠组织gp130、SOCS3蛋白比较无统计学差异。见表2。

表2 各组大鼠结肠组织gp130、SOCS3蛋白表达比较

注：与A组比较,*P<0.05；与B组比较,#P<0.05。

3 讨论

UC是结肠的非特异性免疫性的炎症[5]，是以直肠和结肠浅表性炎症为主的一种肠道慢性疾病，临床表现主要有腹泻、腹痛和黏液脓血便，有时会伴有不同程度的全身症状，还有可能发生癌变。本病病情缠绵容易复发，病因尚不明确，目前认为与免疫、遗传、感染、环境等因素有关。现代西医治疗主要以氨基水杨酸类药物(如柳氮磺吡啶)、激素类药物、免疫抑制剂、生物制剂等为主[6]，但有不良反应及反复发作的情况。有文献认为，UC患者对美沙拉嗪有更好的耐受性，因不良反应导致停药率低[7]。另有报道[8,9]，美沙拉嗪和传统用药柳氮磺吡啶治疗UC均有明显效果，但美沙拉嗪效果更显著，临床治愈率更高，具有良好的安全性和可靠性。从有效性和安全性角度考虑，美沙拉嗪是治疗UC 的理想药物。因此，本研究选用美沙拉秦作为阳性对照组。

根据UC临床症状，其与中医学中的泄泻、大瘕泄等都有相似之处[10]，现代中医临床多归属于泄泻范畴。曹燕飞等[11]将近30年有关UC证候类型及治法的文献进行查阅、整理，频次最多的4个证型为胃肠湿热型、脾肾阳虚型、肝郁脾虚型、脾胃虚弱型。由此可见，肝郁脾虚是UC主要的证型之一。通过前期实验研究发现，因UC病程长，病情缠绵难愈，使患者精神压力不断增大。中医称之肝气郁结，肝郁脾虚，久病则出现精神心理症状。所以，采用具有疏肝健脾功效的痛泻要方治疗，能取得显著疗效。

前期有研究[12]发现，痛泻要方药效作用可能是通过提高结肠组织抗氧化能力和调节结肠组织紊乱的免疫功能以及提高结肠组织过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)的表达实现，从而调控炎症的发展。另有研究[13]证明，痛泻要方通过抑制细胞因子TNF-α和IL-6、提高淋巴细胞转化率来发挥调节细胞免疫的作用治疗UC，并取得了良好的效果。刘海涛等[14]认为，痛泻要方治疗UC疗效明显，其治疗作用与调节UC 大鼠炎性因子IL-6、IL-4密切相关。以上研究均从免疫紊乱的正向调控出发，但对于结肠黏膜微环境中信号通路负性调控因子的研究相对缺乏。本实验从蛋白和基因水平探讨痛泻要方的作用机制，为防治UC提供新思路。

IL-6是活化的T细胞和成纤维细胞产生的淋巴因子，在炎症部位黏膜固有层中T细胞的生存和抗凋亡中扮演重要角色。研究发现，IL-6可能对UC的进程有着深远的影响，结论来自于循环中及结肠组织高浓度的IL-6与病情严重程度相关。

gp130为IL-6受体的两个亚基之一，另外一个亚基是IL-6Rα 。IL-6与IL-6Rα 的结合导致了IL-6Rα与gp130的结合,最终六聚体由两分子IL-6、两分子Ll-6Rα 和两分子gp130组成。IL-6Rα 在胞质区的存在与否并不影响IL-6信号，即IL-6Rα 的胞质区不参与信号传导，故IL-6信号是通过gp130进入细胞内[15]。其进入细胞内后激活JAK2/STAT3，调控STAT3下游靶基因转录，如细胞周期蛋白、凋亡蛋白等，而致T细胞增殖，引起炎症反应失控[16]。这些研究表明，由IL-6 诱导的gp130介导的反应是独特的，阻断IL-6信号转导，可能在本实验中治疗UC有一定作用。

细胞因子信号抑制物SOCS家族是细胞因与受体结合后通过JAK/STAT途径激活的靶基产物，目前发现由SOCS1～SOCS7及CIS1等8种蛋白组成。SOCS3可通过抑制JAK激酶与细胞因子受体结合的活性，以及促进蛋白酶体水解JAK、STAT蛋白等途径，抑制JAK/STAT信号通路的活化,对JAK/STAT途径进行负反馈调节。研究[17]发现，通过上调SOCS3表达，可以抑制脂多糖诱导的TNF-α的产生，从而产生抗炎作用。Berlato等[18]发现LPS可以诱导巨噬细胞产生SOCS3，而产生的SOCS3能够抑制LPS分泌IL-6、TNF-α 等效应分子。由此可见，SOCS3表达的增高可以抑制促炎因子的产生，从而减轻炎症的损害。本研究结果与上述报道一致。

本实验结果表明，UC大鼠结肠组织gp130基因和蛋白表达明显升高，说明gp130与炎症密切相关。使用美沙拉秦与痛泻要方后显著降低，证实了gp130表达量与炎性程度成正相关，与上述理论相符。因此，gp130参与了UC的发病，且病情越重，其表达量越高。本研究发现，痛泻要方对于治疗肝郁脾虚型UC大鼠有良好疗效。美沙拉秦治疗大鼠较模型大鼠一般状况明显好转,结肠组织肉眼评分显示充血、水肿及溃疡明显减轻,印证痛泻要方对UC大鼠结肠黏膜的修复作用明显，其作用机制可能与IL-6、gp130以及SOCS3的负性调控有关。SOCS3作为炎症信号通路抑制因子，随着炎症严重情况而适应性增高，起到负性调控因子作用。上述结果表明，gp130、SOSCS3参与了UC的发病。痛泻要方通过疏肝健脾的整体调节起到缓解、治疗UC的效果。其机制可能是抑制了IL-6与gp130蛋白结合，使炎症反应程度减轻；另一方面可能参与调控IL-6水平，降低gp130基因的转录并提高SOCS3 基因与蛋白的表达。但是，其具体相关作用机制有待进一步研究。

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Effects of Tongxie Yaofang on expression of gp130 and SOCS3 in rats with liver depression and spleen deficiency type ulcerative colitis

YANGYi,ZHUXiangdong,ZHAIYanhui,LITing

(GansuUniversityofChineseMedicine,Lanzhou730000,China)

ObjectiveTo observe the effects of Tongxie Yaofang (Tongxie prescription) on the expression of glycoprotein 130 (gp130) and suppressor of cytokine signaling 3 (SOCS3) gene and protein in colonic tissues of rats with liver depression and spleen deficiency type ulcerative colitis (UC).MethodsSixty rats were randomly divided into groups A, B, C, and D. Rats in the groups B, C, and D were treated with trinitrobenzene sulfonic acid/ethanol solution + restraint stress and improper diet to induce the liver depression and spleen deficiency type UC models. Rats in the group A were treated with the same method by using the same amount of normal saline enema. Rats in the groups C and D were treated with Tongxie Yaofang (crude drug 5.5 g/kg), mesalazine (0.5 g/kg) 10 mL/kg by gavage. Rats in the groups A and B were fed with the same volume of normal saline. After the success of modeling in each group, the rats were treated by gavage, once a day for 21 days. We removed the colon segment from 7 to 8 cm above the anus, and determined the colon mucosal injury score by naked eyes. Real-time fluorescent quantitative PCR, immunohistochemistry, and immunoblotting were used to detect gp130, SOCS3 gene and protein in colon tissues.ResultsThe score of colonic mucosal injury in the group B was 2.67±0.62, which was higher than that of the group A (0.6±0.63) (P<0.01); the score of colonic mucosal injury in the group C and group D was 1.73±0.70 and 1.27±0.46, which was both higher than that of the group B (P<0.01). There was no significant difference between groups C and D. Compared with group A, the expression of gp130 gene and protein in the group B was higher and the expression of SOCS3 gene and protein was lower (allP<0.05). Compared with group B, the expression of gp130 gene and protein in the groups C and D was lower and the expression of SOCS3 gene and protein was higher than that of group B (allP<0.05). There was no significant difference in gp130 and SOCS3 gene and protein between the groups C and D.ConclusionTongxie Yaofang can inhibit the expression of gp130 and up-regulate the expression of SOCS3, so as to improve the degree of colonic mucosal injury of rats with liver depression and spleen deficiency type UC.

ulcerative colitis; Tongxie Yaofang; mesalazine; glycoprotein 130; suppressor of cytokine signaling 3; rats

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.34.006

R574.62；R975

A

1002-266X(2017)34-0020-04

2016-12-03)

国家自然科学基金资助项目(81460696)。

杨意(1990-)，男，硕士研究生，主要研究方向为中医治则治法及其临床应用。E-mail: 844460037@qq.com

朱向东(1973-)，男，博士，教授，主要研究方向为中医治则治法及其临床应用。E-mail: zhuxiangdong33@163.com