亚胺培南与舒巴坦联合应用对多重耐药肺炎克雷伯菌的体外抗菌活性分析

周翔 孔晓明

·药物研究·

亚胺培南与舒巴坦联合应用对多重耐药肺炎克雷伯菌的体外抗菌活性分析

周翔 孔晓明

目的分析亚胺培南与舒巴坦联合应用对多重耐药肺炎克雷伯菌(KPN)的体外抗菌活性。方法选择2013年7月至2016年4月临床住院患者的48份标本，共分离出48株多重耐药肺炎克雷伯菌菌株，实施改良Hodge实验，分析其是否为产碳青霉烯酶KPN，并分析KPN-CSTI抗生素药敏及联合药敏实验结果。结果48株受试菌株全部为产碳青霉烯酶KPN；34株(70.83%)多粘菌素药敏实验为敏感，14株(29.17%)为中介，其中12株(85.71%)对庆大霉素耐药，2株(14.29%)对庆大霉素敏感，14株(100.00%)均对头孢哌酮-舒巴坦、头孢吡肟、亚胺培南耐药；亚胺培南+头孢哌酮-舒巴坦显示出显著的协同作用(ΣFIC≤0.05)。结论头孢哌酮-舒巴坦联合亚胺培南使用时可具有协同作用，对临床治疗KPN的疗效有提高作用，可作为临床调整治疗方式的实验依据。

多重耐药；肺炎克雷伯菌；亚胺培南；头孢哌酮-舒巴坦；体外抗菌

KPN是一种临床较为普遍的条件致病菌，近几年，KPN对常用的抗菌药物的耐药性逐渐增大[1]。随着碳青霉烯类药物的广泛应用，其耐药的KPN比例呈不断升高趋势，不仅给临床抗感染治疗制造巨大的难度，且影响患者的治疗效果[2]。目前，临床关于其在多重耐药革兰阴性菌中的治疗效果的报道较多，且其已被部分医院用于治疗重症患者中。临床实践显示，多粘菌素对大部分多重耐药菌具有较高的体外活性，少许菌株会对其产生耐药或中介现象[3,4]。基于此，本研究选取48株多重耐药肺炎克雷伯菌菌株，旨在进一步探讨亚胺培南与舒巴坦联合应用对多重耐药KPN的体外抗菌活性。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2013年7月至2016年4月于我院临床住院患者标本48份，其中尿液2份，咽拭子2份，痰42份，导管2份，采用K-B法药敏检测法及上海复星佰珞BIOFOSUN细菌分析仪共分离出48株多重耐药肺炎克雷伯菌菌株。

1.2 材料与仪器 (1)仪器:上海复星佰珞BIOFOSUN细菌分析仪，M-H平板，哥伦比亚血平板，美罗培南药敏纸片。(2)药物:亚胺培南(浙江海正药业股份有限公司)，多粘菌素(浙江日升昌药业有限公司)，庆大霉素(紫光古汉集团衡阳制药有限公司)，头孢哌酮-舒巴坦[石药集团中诺药业(石家庄)有限公司]，头孢吡肟(广州白云山制药股份有限公司广州白云山制药总厂)。

1.3 改良Hodge实验 检测碳青霉烯酶的最简便方式即为Hodge实验，具体操作步骤为：将E.coli ATCC 25922菌株放置于0.9%氯化钠溶液中配置成0.5麦氏浊度的菌液，按照1∶10比例进行稀释，并将其均匀涂布在M-H平板上，放置4～10 min，若M-H平板干燥，则将10 mg美罗培南纸片贴于平板中央。采用接种环挑取培养24 h的受试菌株，在纸片边缘与平板边缘之间划一直线，将其放置于孵箱孵育，温度设置为37℃，孵育20～24 h后对结果进行观察。若划线与美罗培南的抑菌环的交界处显示出增强生长，则提示划线的菌株碳青霉烯酶。阳性对照为K.pneumoniae ATCC BAA-1705，阴性对照为K.pneumoniae ATCC BAA-1706。

1.4 抗菌药物敏感实验 根据药品说明书、CSLI操作标准第25版对肉汤、抗菌药物进行配置，并根据相关判断标准对多粘菌素对KPN的最低抑菌浓度(MIC)进行判定[5]。

1.4.1 测定多粘菌素MIC:多粘菌素的药敏实验按照微量肉汤稀释法实施，将50 ml Mueller-Hinton肉汤加入96孔板的每行第2～12孔中，并将100 ml的512 U/ml多粘菌素加入每行第1孔与第2孔，从第2孔按倍比进行稀释至第11孔，对照孔为第12孔。从受试菌株中挑取培养20～24 h的菌株单个菌落配制成0.5麦氏浊度的菌液，按1∶200比例进行稀释，并于相应排的第1～12孔加入上述菌液。将其置入于孵箱孵育，温度设置为37℃，孵育20～24 h后对结果进行观察。MIC值为未出现浑浊生长的浓度。对其进行筛选，最终选出14株多粘菌素药敏实验为中介(KPN-CSTI)，并实施后续实验。

1.4.2 测定单药MIC:分别对头孢哌酮-舒巴坦、亚胺培南、头孢吡肟、庆大霉素实施药敏实验，对其MIC值进行测定，方法与多粘菌素MIC值的测定方式一致。

1.4.3 测定联合用药MIC:本次研究将抗生素分为以下4种组合方式，具体包括：亚胺培南+庆大霉素、亚胺培南+头孢哌酮-舒巴坦、头孢哌酮-舒巴坦+多粘菌素、亚胺培南+头孢吡肟。按照微量棋盘法测试上述组合的抗菌活性。各药物与MHB均于当天进行配制，并将其浓度稀释至所需浓度，将血平板上37℃培养的受试菌株配制成0.5麦氏浊度的菌液，按1∶200比例进行稀释，再加入96孔板，每孔均为100 ml，并分别于每孔加入50 ml相应浓度的抗菌药物。

1.4.4 结果判定及解释:按照ΣFIC=FIC-A+FIC-B的计算公式对药物组合的抗菌活性进行计算，其中在B药物存在时A药物的MIC值与A药物单独的MIC之间的比值记为FIC-A，而A药物存在时B药物的MIC值与B药物单独的MIC之间的比值记为FIC-B。当ΣFIC≤0.5时，联合药敏试验的结果判定为协同作用，当ΣFIC>4时为拮抗作用，当ΣFIC≤4时为无关作用。

2 结果

2.1 改良Hodge实验 本组48株受试菌株的抑菌环与划线的交界处均出现不同程度的增强生长，提示48株受试菌株全部为产碳青霉烯酶KPN。见图1。

图1 改良Hodge实验

2.2 测定多粘菌素MIC 本组48株受试菌株中，有34株(70.83%)多粘菌素药敏实验为敏感，另14株(29.17%)为中介。

2.3 测定单药MIC 14株多粘菌素药敏实验为中介(KPN-CSTI)，12株(85.71%)对庆大霉素耐药，2株(14.29%)对庆大霉素敏感，14株(100.00%)均对头孢哌酮-舒巴坦、头孢吡肟、亚胺培南耐药。见表1。

表1 KPN-CSTI抗生素药敏实验结果分析

2.4 测定联合用药MIC 4种组合中，亚胺培南+头孢哌酮-舒巴坦显示出显著的协同作用；在头孢哌酮-舒巴坦的联合作用下，亚胺培南的MIC值明显下降，MIC≤1(42.86%，敏感)、MIC=2(28.57%，中介)、MIC=4(28.57%，耐药)，其余3组均未显示出协同作用。见表2。

3 讨论

KPN是一种导致临床感染的主要条件致病菌，可引发诸多感染，增加院内感染率。产质粒介导的头孢菌素酶及超广谱β-内酰胺酶与该菌耐药机制相关，在广谱抗生素广泛应用造成的选择性压力下，耐药株常携带抗菌药物耐药基因，常见包括喹诺酮类、氯霉素、碳青霉烯类、磺胺类、氨基糖苷类等[6]，可同时出现多种耐药机制，具有多重耐药、泛耐药等特点。相关数据显示，多重耐药KPN在KPN感染中占比高达13.4%以上，且比例呈逐年增长趋势[7]。多重耐药KPN为严重致死性院内感染的主要病原菌之一，在一定程度上容易造成医院获得性菌血症、肺炎等[8]，在重症监护病房中尤为常见，为临床治疗带来极大难度。

碳青霉烯类耐药KPN具有诸多耐药机制，最常见的机制为产生可以水解碳青霉烯类抗菌药物的KPC，其可以大部分抑制碳青霉烯类抗菌药物及β-内酰胺酶[9]。多粘菌素属于杀菌药一种，其杀菌作用机制为对细胞外膜磷脂进行破坏，增高细胞壁通透性，促进细胞死亡，进而产生抗菌效果，且大部分革兰氏阴性杆菌对多粘菌素敏感[10]。近年来，随着临床研究不断深入，多粘菌素单用或联合抗菌药物已被临床广泛应用于多重耐药的鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌等感染治疗中，且取得较显著疗效[11,12]。本次药敏结果显示，48株受试菌株全部为产碳青霉烯酶KPN，且未出现耐药情况，表明多粘菌素对产碳青霉烯酶KPN表现较强的杀菌效果。但存在14株菌株的MIC值为中介，对多粘菌素的敏感性较低。本研究将此14株KPN与抗菌药物(头孢哌酮-舒巴坦、亚胺培南、头孢吡肟、庆大霉素)进行联合实验。结果显示，亚胺培南+头孢哌酮-舒巴坦显示出显著的协同作用(ΣFIC≤0.05)，且较其余3组具有明显的联合作用。究其原因在于头孢哌酮-舒巴坦属于β-内酰胺酶抑制剂一种，病原菌β-内酰胺酶对其β-内酰胺环进行水解的同时，可不可逆与其相结合发挥抑制β-内酰胺酶作用，使其可与靶位青霉素联合，进而产生直接杀菌效果，降低碳青霉烯类抗生素耐药酶产生[13-15]。本研究结果还显示，在头孢哌酮-舒巴坦的联合作用下，亚胺培南的MIC值明显下降，进一步提示头孢哌酮-舒巴坦+亚胺培南可发挥清除微生物的功效。

表2 KPN-CSTI联合药敏实验结果分析

注：ΣFIC=FIC-A+FIC-B

综上所述，头孢哌酮-舒巴坦联合亚胺培南使用时可具有协同作用，对临床治疗KPN的疗效有提高作用，可作为临床调整治疗方式的实验依据。

1 余悦能，张祎萍，金旭红，等.肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌产超广谱β-内酰胺酶菌株的临床特点及感染的危险因素.浙江医学，2016，38:728-731，734.

2 岳欣，田文君，王鹏，等.产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的耐药及TEM与SHV基因型分析.中华医院感染学杂志，2016，26:3125-3128.

3 郭力源.头孢哌酮舒巴坦治疗耐碳青酶烯类鲍氏不动杆菌重症肺炎的疗效观察.现代诊断与治疗，2016，27:1237-1239.

4 Ling T，Wang Y，Wang X，et al.Prevalence of Resistant Gram-Negative Bacilli in Bloodstream Infection in Febrile Neutropenia Patients Undergoing Hematopoietic Stem Cell Transplantation:A Single Center Retrospective Cohort Study.Medicine，2015，94:e1931.

5 蓝大波，吴晓梁，徐良志.替加环素联合头孢哌酮钠舒巴坦钠治疗高龄多重耐药鲍曼不动杆菌肺炎患者的疗效及安全性分析.浙江创伤外科，2016，21:58-60.

6 安庆丽，喻昌利，王键玮，等.头孢哌酮舒巴坦联合米诺环素治疗多重耐药鲍曼不动杆菌肺炎疗效评价.实用药物与临床，2016，19:558-561.

7 张可，蔡文伟，许秋然.替加环素和头孢哌酮钠舒巴坦钠治疗多重耐药鲍曼不动杆菌肺炎的比较研究.中华危重症医学杂志(电子版)，2016，9:116-119.

8 Yi Y，Cai H，Leck TP，et al.Using an Adenosine Triphosphate Bioluminescent Assay to Determine Effective Antibiotic Combinations against Carbapenem-Resistant Gram Negative Bacteria within 24 Hours.Plo S one，2015，10:e0140446.

9 厉玲，刘蕾.替加环素结合舒巴坦对多重耐药鲍曼不动杆菌病原微生物的治疗效果观察.中国微生态学杂志，2015，27:1451-1453.

10 王菊梅，张洪球，陆军.同一患者不同部位碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌的耐药机制和同源性分析.中华临床感染病杂志，2016，9:369-372.

11 杨军辉，李佳，李宁，等.多粘菌素E、替加环素及比阿培南联合舒巴坦对多重耐药鲍曼不动杆菌肺炎治疗的对比研究.陕西医学杂志，2016，45:756-757.

12 Sandra W，Thrane VL，Taylor L，et al.The Widespread Multidrug-Resistant Serotype O12 Pseudomonas aeruginosa Clone Emerged through Concomitant Horizontal Transfer of Serotype Antigen and Antibiotic Resistance Gene Clusters.mBio，2015，6:e01396-1415.

13 臧会玲，王生池，程慧，等.替加环素联合头孢哌酮/舒巴坦治疗多重耐药及泛耐药鲍曼不动杆菌临床效果分析.中国综合临床，2016，32:41-43.

14 赵华，吴健，杨爱祥，等.以替加环素为基础的联合用药治疗多耐药和泛耐药鲍曼不动杆菌感染医院获得性肺炎的临床研究.临床和实验医学杂志，2015，14:2103-2105.

15 曹慧玲，舒钊彻，杨琳，等.亚胺培南与舒巴坦联合应用对多重耐药肺炎克雷伯菌的体外试验研究.实用医学杂志，2016，32:475-478.

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.20.038

213300 江苏省溧阳市人民医院检验科

孔晓明，213300 江苏省溧阳市人民医院检验科；

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R 563.1

A

1002-7386(2017)20-3171-03

2017-05-23)

项目来源：江苏大学医学临床科技发展基金项目(编号：JLY20140095)；溧阳市重点研发计划(社会发展)项目(编号：LC2015010)