CCDC12蛋白在结直肠癌组织表达情况与肿瘤化疗药物抵抗的关系

耿玮 梁巍 范亚男 叶智斌 张梦阳

·论著·

CCDC12蛋白在结直肠癌组织表达情况与肿瘤化疗药物抵抗的关系

耿玮 梁巍 范亚男 叶智斌 张梦阳

目的探讨结直肠癌组织中CCDC12蛋白表达与肿瘤细胞化疗效果的关系及意义。方法留取84例结直肠癌手术患者的肿瘤及癌旁正常肠黏膜的石蜡组织及新鲜组织，免疫组化技术检测CCDC12蛋白、多药耐药蛋白1(MRP-1)、P-糖蛋白(P-gp)、生存素(Survivin)、凋亡酶激活因子-1(Apaf-1)的表达情况；噻唑蓝(MTT)法检测氟尿嘧啶(5-Fu)、顺铂(CDDP)、奥沙利铂(L-OHP)对肿瘤细胞的抑制作用。另取20例结直肠癌患者的肿瘤及癌旁正常肠黏膜新鲜标本，蛋白印迹法(Western blotting)检测CCDC12、MRP-1、P-gp、Survivin、Apaf-1的表达情况。结果免疫组化结果显示CCDC12、MRP-1、P-gp、Survivin在结直肠癌组织中表达均明显高于癌旁正常肠黏膜，Apaf-1 在结直肠癌组织中表达降低(均P<0.05)。5-Fu、L-OHP对CCDC12阳性表达的结直肠癌细胞抑制率低于阴性表达者(均P<0.05),而CDDP对肿瘤细胞的抑制作用与CCDC12表达无明显关系 (P>0.05)。5-Fu对结直肠癌细胞的抑制情况与MRP-1、P-gp表达有关；CDDP对肿瘤细胞的抑制情况与Survivin有关；L-OHP对肿瘤细胞的抑制作用与Survivin、Apaf-1有关(均P<0.05)。相关分析显示，结直肠癌组织中CCDC12蛋白与P-gp、Survivin均呈正相关，与Apaf-1呈负相关 (均P<0.05)。Western blot结果与免疫组化相符。结论CCDC12蛋白在结直肠癌组织中表达增高并与化疗药物的效果有关，CCDC12蛋白参与了结直肠癌的耐药形成并可能成为耐药性逆转的靶蛋白。

结直肠癌；CCDC12蛋白；化疗，药物抵抗

结直肠癌是我国常见的消化道恶性肿瘤，发生率在近年来有所升高[1]。由于结直肠癌起病隐匿、进展迅速，大多患者就诊时多已处于进展期。对这些患者的治疗是以手术联合化疗为主的综合治疗，化疗在其中发挥了重要作用[2]。但由于结肠癌细胞对于多种化疗药物存在抵抗能力即多药耐药性(multidrug resistance,MDR)，且在化疗过程中细胞的这种耐药能力还会进一步增强[3,4]。这是导致患者化疗失败的主要原因，也是患者术后复发转移的重要原因。结直肠癌细胞的耐药形成机制与多种基因、多种耐药通路有关，但具体机制尚未阐明。近期有研究发现卷曲螺旋结构域(coiled-coil domain-containing,CCDC)基因家族中的CCDC12与结直肠癌有关[5]，但该基因是否与结直肠癌细胞的耐药形成有关目前报道极少。故本研究检测了结直肠癌组织中CCDC12蛋白的表达，并分析了CCDC12蛋白与结直肠癌细胞体外药敏性的关系，进一步分析了CCDC12与耐药相关蛋白质多药耐药蛋白1(MRP-1)、P-糖蛋白(P-gp)、生存素(Survivin)、凋亡酶激活因子-1(Apaf-1)的关系，初步对CCDC12蛋白与结直肠癌耐药的关系进行了分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料 以2014年1月至2015年6月于河北省人民医院外科确诊并手术的结直肠肿瘤患者84例为研究对象，患者均有手术切除标本确诊，术前未接受过新辅助放化疗，患者均不合并其他肿瘤。患者中男54例，女30例；年龄37～81岁，平均年龄(54.50±8.87)岁。术中肿瘤离体后取肿瘤组织一式两份，每份均约1.0×1.0×0.5 cm3，一份置于4%中性甲醛中固定用于免疫组化检测，另一份置于-80℃保存用于化疗药敏性检测。另取一份癌旁正常肠黏膜组织(距肿瘤边缘≥5 cm，术后镜下检测无癌及非典型增生组织)置于4%中性甲醛用于免疫组化检测。

1.2 主要试剂及仪器 CCDC12为美国Aviva公司产品，MRP-1、P-gp、Survivin、Apaf-1抗体为美国Sigma公司产品，免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒均购自北京中杉生物公司。噻唑蓝(methylthiazolydiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)为美国Sigma公司产品，氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-Fu)为沈阳药大公司产品(40 mg/支，国药准字H21023380)、顺铂(Cisplatin,CDDP)为齐鲁制药公司产品(10 mg/支，国药准字H37021358)、奥沙利铂(oxaliplatin,L-OHP)为杭州赛诺菲公司产品(50 mg/支,国药准字J20100064)。切片机(RM2255型)、组织细胞染色机(ST5020型)均为德国LEICA公司产品。

1.3 免疫组化检测及结果判断 将固定好的肿瘤及癌旁正常肠黏膜组织石蜡包埋，在切片机上连续4 μm切片，然后进行脱蜡、水化、抗原修复、阻断内源性过氧化物酶(peroxidase,POD)活性，分别加入各一抗，浸泡、冲洗后加入二抗，37℃孵育30 min，最后进行显色、复染、封片。阴性对照为磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)，阳性对照为各一抗提供的阳性对照。CCDC12、Survivin、Apaf-1蛋白均以在细胞浆或细胞膜出现黄色或棕色颗粒为染色阳性；MRP-1、P-gp的黄色或棕色颗粒主要出现在细胞膜，少量出现在细胞浆内。在400×镜下随机选取5个视野，应用二次计分法将阳性细胞比例与染色强度的乘积作为读片结果。乘积为0记为(-)，1～2记为(+)，3～4记为(++)，>4记为(+++)。(-)为阴性表达，其他均记为阳性表达。

1.4 MTT法检测结直肠癌细胞的体外药物敏感性 将肿瘤新鲜组织以PBS缓冲液冲洗后使用200目细胞筛将组织制备为单细胞悬液，将细胞浓度调整为106/ml，接种于96孔板进行培养。待细胞贴壁后更换培养液，每孔加入100 μl，再培养4 h后分别加入5-Fu(10 μg/ml)、CDDP(10 μg/ml)、L-OHP(5 μg/ml)对照孔仅加入等量培养基。加入化疗药物后培养20 h后各孔加入MTT(5 mg/ml)10 μl，继续培养4 h。待结晶形成后弃上清，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150 μl，于摇床上震荡10 min。于酶标仪490 nm处测定各孔的吸光值。计算药物对细胞的抑制率(Inhibitory rate,IR)，Ir=(1-给药孔吸光值/对照组吸光值)×100%。

2 结果

2.1 结直肠癌组织与癌旁正常肠黏膜组织CCDC12、MRP-1、P-gp、Survivin、Apaf-1蛋白表达的免疫组化结果 在结直肠癌组织中，CCDC12阳性表达率为72.62%(61/84)、MRP-1阳性率为76.19%(64/84)、P-gp阳性率为83.33%(70/84)、Survivin阳性率为82.14%(69/84)、Apaf-1阳性率为39.29%(33/84)，癌旁正常肠黏膜组织中CCDC12、MRP-1、P-gp、Survivin、Apaf-1阳性率分别为17.86%(15/84)、25.00%(21/84)、21.43%(18/84)、9.52%(8/84)、57.14%(48/84)。经χ2检验，CCDC12、MRP-1、P-gp、Survivin蛋白在结直肠癌组织中阳性表达率均明显高于癌旁正常肠黏膜组织 (P<0.05)，Apaf-1蛋白在结直肠癌组织中阳性表达率明显低于癌旁正常肠黏膜组织 (P<0.05)。见表1。

2.2 结直肠癌组织CCDC12、MRP-1、P-gp、Survivin、Apaf-1蛋白表达与化疗药物敏感性关系 5-Fu、L-OHP对CCDC12阳性表达的结直肠癌细胞抑制率低于阴性表达者(均P<0.05),而CDDP对肿瘤细胞的抑制作用与CCDC12表达无明显关系 (P>0.05)。5-Fu对结直肠癌细胞的抑制情况与MRP-1、P-gp表达有关；CDDP对肿瘤细胞的抑制情况与Survivin有关；L-OHP对肿瘤细胞的抑制作用与Survivin、Apaf-1有关(均P<0.05)。见表2。

表1 结直肠癌和癌旁组织中CCDC12、MRP-1、P-gp、Survivin、Apaf-1蛋白的表达情况 n=84，例

项目CCDC12阳性(n=61)阴性(n=23)MRP⁃1阳性(n=64)阴性(n=20)P⁃gp阳性(n=70)阴性(n=14)Survivin阳性(n=65)阴性(n=19)Apaf⁃1阳性(n=33)阴性(n=51)5⁃Fu41．06±17．2051．11±13．7540．92±17．7953．06±8．6142．10±17．1152．40±12．8443．43±18．8845．12±6．3343．09±10．1044．28±20．15t值-2．513-2．973-2．131-0．383-0．314P值0．0140．0040．0360．7030．754L⁃OHP44．39±18．1656．21±7．2247．37±17．0148．43±16．2347．53±17．7448．07±10．8944．43±17．2658．56±8．3752．66±9．6644．37±19．44t值-3．023-0．246-0．110-3．4412．272P值0．0030．8060．913<0．0010．026CDDP24．63±7．2725．09±6．6824．90±7．0324．32±7．3924．82±7．0424．45±7．5623．54±6．5128．94±7．5225．27±7．5824．43±6．79t值-0．2640．3180．177-3．0700．529P值0．7920．7510．8600．0030．598

2.3 结直肠癌组织中CCDC12与MRP-1、P-gp、Survivin、Apaf-1蛋白表达的关系 经Spearman相关分析，结果显示在结直肠癌组织中，CCDC12与P-gp、CCDC12与Survivin蛋白表达具有正相关性(r=0.3552，P<0.001；r=0.3012，P=0.005)，CCDC12与Apaf-1表达具有负相关关系(r=-0.2261，P=0.039)。

2.4 结直肠癌组织与癌旁组织CCDC12、MRP-1、P-gp、Survivin、Apaf-1蛋白表达的Western blot结果 CCDC12、MRP-1、P-gp、Survivin蛋白在结直肠癌组织中表达强度均明显高于癌旁正常肠黏膜组织 (P<0.05)，Apaf-1蛋白在结直肠癌组织中表达强度明显低于癌旁正常肠黏膜组织 (P<0.05)。Western blot结果与免疫组化结果符合。见图1。

3 讨论

化疗是结直肠癌治疗的重要措施，尤其对手术后及出现转移的进展期结直肠癌患者，化疗更是主要的治疗手段。但由于结直肠癌细胞具有较强的药物抵抗能力，常常导致化疗失败，造成肿瘤复发或进一步转移扩散。因此，采取措施逆转肿瘤细胞对化疗药物的抵抗能力有重要的临床意义。本研究使用的5-Fu、CDDP、L-OHP均为用于结直肠癌化疗的常用药物[6-8]，结果发现单药对肿瘤细胞的抑制率均低于40%，证实结直肠癌细胞对化疗药物有较强的抵抗能力，从分子角度探讨结直肠癌细胞的耐药机制有重要意义。对结直肠癌耐药机制的研究已进行多年并得到了许多结果，但具体机制尚未完全阐明。卷曲螺旋结构域(coiled-coil domain-containing,CCDC)12基因是CCDC家族的成员之一，该家族有众多成员，近年来研究发现该家族的多个成员与恶性肿瘤关系密切[9-11]。有研究表明CCDC12与结直肠癌有关。但CCDC12是否参与了结直肠癌的药物抵抗过程目前报道极少。本结果发现CCDC12蛋白在结直肠癌组织中表达明显高于癌旁正常肠黏膜，免疫组化及Western blot都证实了这点。结果还发现5-Fu、L-OHP对CCDC12阳性表达的结直肠癌细胞抑制率低于阴性表达者，提示CCDC12可能参与了结直肠癌细胞对5-Fu、L-OHP的耐药形成；而CDDP对肿瘤细胞的抑制作用与CCDC12表达无明显关系则提示肿瘤细胞对不同药物的耐药可能有多种机制参与其中，具体情况还有待深入分析。

图1 癌组织与癌旁组织CCDC12、MRP-1、P-gp、Survivin、Apaf-1蛋白表达情况(Western blot)

注：A:凝胶电泳图;B:直方图;与癌组织比较,*P<0.05

为初步了解CCDC12参与结直肠癌细胞耐药的机制，本研究进一步检测了与肿瘤耐药关系密切的MRP-1、P-gp、Survivin、Apaf-1蛋白表达情况。MRP-1属于ABC转运蛋白超家族，它与P-gp都属于经典耐药途径的代表性蛋白。MRP-1与P-gp位于细胞膜上，主要功能是把进入细胞的药物通过主动转运的耗能方式运至细胞外[12,13]。Survivin是分子量最小的凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)家族成员，能使细胞凋亡抵抗能力增强，导致铂类等以诱导细胞凋亡为主要机制的化疗药物效果减弱[14]。Apaf-1则具有促进肿瘤细胞凋亡的能力，能通过激活caspase-9而促进肿瘤细胞凋亡[15]。本研究发现在结直肠癌组织中MRP-1、P-gp、Survivin存在表达增高现象，而Apaf-1表达低于正常肠黏膜。分析这些蛋白与肿瘤细胞药敏性的关系，发现5-Fu对结直肠癌细胞的抑制情况与MRP-1、P-gp表达有关，MRP-1、P-gp表达阳性的肿瘤组织对5-Fu抑制率低于阴性表达者。CDDP对肿瘤细胞的抑制情况与Survivin有关，Survivin阳性表达的肿瘤细胞对CDDP的敏感性较低。L-OHP对肿瘤细胞的抑制作用与Survivin、Apaf-1，该药对Survivin表达阳性的肿瘤抑制率低于阴性表达者，而对Apaf-1阳性肿瘤的抑制率则高于Apaf-1阴性者。这些结果证实了MRP-1、P-gp、Survivin、Apaf-1参与了结直肠癌耐药并发挥了作用，但也提示与不同药物耐药相关的蛋白并不一致，结直肠癌耐药是复杂的多因素过程。

为初步分析CCDC12与其他耐药相关蛋白质的关系，本研究检测了CCDC12与MRP-1、P-gp、Survivin、Apaf-1蛋白的相关性，结果发现结直肠癌组织中CCDC12蛋白与P-gp、Survivin均呈正相关，与Apaf-1呈负相关。提示CCDC12可能通过调控这些蛋白的功能而参与了结直肠癌耐药，但具体机制还需要基础研究予以探讨。

本研究证实结直肠癌组织中CCDC12存在表达增高现象，CCDC12与5-Fu、L-OHP的药物效果有关，且推测CCDC12可能通过调节P-gp、Survivin、Apaf-1而参与了结直肠癌耐药。但本研究例数较少，且未进行相关基础研究。有关CCDC12与结直肠癌关系的研究还应深入探讨。

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ExpressionofCCDC12proteinincolorectalcancertissuesanditsrelationshipwithchemotherapeuticsresistance

GENGWei,LIANGWei,FANYanan,etal.

TheFifthDepartmentofGeneralSurgery,HebeiProvincialPeople’sHospital,Shijiazhuang050051,China

ObjectiveTo investigate the correlation and significance between expression of CCDC12 protein and therapeutic effects of chemotherapy on colorectal cancer.MethodsThe expressions levels of CCDC12,MRP-1,P-gp, Survivin, Apaf-1 proteins were detected by immunohistochemistry in 84 cases of colorectal cancer (tissue specimens). The inhibitory effects of chemotherapeutics 5-Fu,CDDP,L-OHP on tumor cells were detected by MTT assay.Moreover the expressions levels of CCDC12,MRP-1,P-gp,Survivin,Apaf-1 proteins in fresh tissues of 20 cases of colorectal cancer and mucous membrane tissues beside cancer were detected by Western Blot assay.ResultsThe expressions levels of CCDC12,MRP-1,P-gp,Survivin proteins in colorectal cancer tissues were obviously higher than those in normal intestine mucous membrane,however, the expression levels of Apaf-1 were decreased in colorectal cancer tissues (P<0.05).The inhibitory rates of 5-Fu,L-OHP on tumor cells with positive expression of CCDC12 were significantly lower than those with negative expression of CCDC12 (P<0.05),but there was no obvious correlation between the inhibitory effects of CDDP on tumor cells and expression of CCDC12 (P>0.05).The inhibition effects of 5-Fu on tumor cells were related with the expressions of MRP-1 and P-gp proteins,and the inhibition effects of CDDCP on tumor celles were related with expressions of Survivin protein,moreover, the inhibition effects of L-OHP were correlated to expressions of Survivin,Apaf-1 proteins. The correlation analysis showed that the expressions of CCDC12 protein in colorectal cancer tissues were positively correlated to those of P-gp,Survivin,however,which were negatively correlated to those of Apaf-1 (P<0.05).ConclusionThe expression levels of CCDC12 protein are increased in colorectal cancer tissues,which is correlated to the therapeutic effects of chemotherapy on colon cancer.Moreover CCDC12 may be involved in chemotherapeutics resistance,which may be a potential target protein for drug resistance reversion.

colorectal cancer; CCDC12 protein; chemotherapy; drug resistance

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.20.005

R 735.3

A

1002-7386(2017)20-3064-04

2017-06-20)

050051 石家庄市，河北省人民医院普外五科