RNA恒温扩增实时检测技术快速鉴定偶发分枝杆菌的研究

逄文慧，李园园，胡忠义，范 琳，赵阳国，崔振玲

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2017.09.002

RNA恒温扩增实时检测技术快速鉴定偶发分枝杆菌的研究

逄文慧1,2，李园园2，胡忠义2，范 琳2，赵阳国1，崔振玲2

目的建立RNA恒温扩增实时检测技术快速鉴定偶发分枝杆菌(RIARD-MF)的方法，评估其在鉴定分枝杆菌临床分离株中的应用效果。方法将偶发分枝杆菌的16S rRNA特异序列作为目的靶标进行检测，设计含T7启动子逆转录扩增引物和RNA探针，分别对5种非分枝杆菌细菌、20种分枝杆菌标准株和259株临床分枝杆菌分离株进行42 ℃恒温扩增实时检测，参考标准为PCR基因测序结果。结果RIARD-MF方法学检测灵敏度可达60 CFU/mL。在25种细菌的RIARD-MF特异性检测中：只有偶发分枝杆菌检测结果为阳性，其余24种细菌均为阴性，与测序检测结果一致。在检测分枝杆菌临床分离菌株时，RIARD-MF鉴定偶发分枝杆菌5株，其余为非偶发分枝杆菌，与测序结果一致，检测灵敏度和特异度均为100%。结论RIARD-MF鉴定偶发分枝杆菌具有较高的特异度、灵敏度和准确性，且检测快速，有望成为一种新的偶发分枝杆菌临床分离菌株鉴定方法。

RNA恒温扩增；鉴定；偶发分枝杆菌

偶发分枝杆菌(Mycobacteriumfortuitum)作为非结核分枝杆菌(nontuberculousmycobacteria，NTM)的一种，可存在于水、土壤、灰尘等自然环境中，并且因其对消毒剂及重金属的耐受性使其能生存于饮水系统中。皮肤黏膜、呼吸道、胃肠道等都是偶发分枝杆菌可侵入人体的途径，偶发分枝杆菌侵入人体后可引起无症状的感染，或引起肺部病变、消化道病变、皮肤软组织病变、骨关节病变、淋巴结病变等。机体免疫功能低下者如AIDS患者还可能进一步引起全身播散性的传染病。近来医源相关性偶发分枝杆感染菌病逐渐增多，如血液透析、静脉导管相性血行感染、手术或注射部位的偶发分枝杆菌感染等。偶发分枝杆菌对传统抗结核药物高度耐药，但对头孢西丁、亚胺培南和阿奇霉素等抗生素敏感[1]。由于偶发分枝杆菌亦为抗酸阳性杆菌，仅根据抗酸涂片染色法易被误判为结核分枝杆菌，而传统的生化鉴定需要较长时间，因此，在诊断和治疗NTM感染时，若能准确快速地鉴定出偶发分枝杆菌，不仅对病人的快速康复有重大意义，同时又可增加对偶发分枝杆菌感染的流行病学研究。本研究建立了RNA恒温扩增实时检测技术鉴定偶发分枝杆菌(RNA isothermal transcription-mediated amplification and real-time detection forMycobacteriumfortuitum，RIARD-MF)的方法，并评估了该方法检测临床分离株的应用效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 呼吸道非分枝杆菌 由同济大学附属上海市肺科医院检验科提供5种经过16S rRNA测序鉴定的呼吸道非分枝杆菌，依次为：铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、绿脓假单胞菌(Pseudomonaspyocyaneum)、溶血性链球菌(Hemolyticstreptococcus)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)。

1.1.2 分枝杆菌标准株 来源于国家菌种保存中心的20种分枝杆菌标准株，分别为：偶发分枝杆菌(M.fortuitum, ATCC6481)、结核分枝杆菌标准株H37Rv(M.tuberculosis, ATCC27294)、土分枝杆菌(M.terra, ATCC19619)、鸟分枝杆菌(M.avium, ATCC25291)、新金色分枝杆菌(M.neoaurum, ATCC25795)、田鼠分枝杆菌(M.microti, ATCC19422)、母牛分枝杆菌(M.vaccae, ATCC15483)、马尔摩分枝杆菌(M.malmoense, ATCC29571)、瘰疬分枝杆菌(M.scrofulaceum, ATCC19981)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansassi, ATCC12478)、金色分枝杆菌(M.aurum, ATCC23366)、龟分枝杆菌(M.chelonae, ATCC14472)、戈登分枝杆菌(M.gordonae, ATCC14470)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis, ATCC19420)、副偶发分枝杆菌(M.parafortuitum, ATCC19686)、爱知分枝杆菌(M.aichiense, ATCC27280)、淡黄分枝杆菌(M.gilvum, ATCC43909)、草分枝杆菌(M.phlei, ATCC11758)、不产色分枝杆菌(M.nonchromogenicum, ATCC19530)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare, ATCC13950)。

1.1.3 结核分枝杆菌临床分离株 由同济大学附属上海市肺科医院结核实验室菌株库提供的临床结核分枝杆菌分离株43株和临床NTM分离株216株。

1.1.4 实验菌株的培养 20种分枝杆菌标准株和259株临床分枝杆菌分离株的培养采用Middlebrook 7H10培养基；溶血性链球菌接种于血平板培养基培养；其他4种呼吸道非分枝杆菌接种于麦康凯培养基培养。

1.2 方法

1.2.1 RIARD-MF法的建立 RIARD-MF鉴定偶发分枝杆菌的方法参考李园园[2-4]等采用RNA恒温扩增实时检测技术鉴别胞内分枝杆菌和鸟分枝杆菌的方法。将偶发分枝杆菌的16S rRNA特异序列作为目的靶标，设计逆转录扩增引物(含T7启动子)和RNA探针，建立偶发分枝杆菌RNA恒温扩增体系。RNA探针的序列(5′→3′)：CGUGGACCACGCGCUUCACCACG，FAM标记探针的5′端，DABCYL标记探针的3′端，由上海吉玛制药技术有限公司合成；上、下游引物的序列(5′→3′)：TTCTAAGCCTGGGAAA和AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACCAACAAGCT GATAGGC，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用DEPC处理过的无菌H2O配制成10 mmol/L柠檬酸钠(pH 8.0)，作为样本稀释液。收集培养至对数期的待检菌株的阳性培养物，用生理盐水将其比浊至1 mg/mL，取1 mL菌悬液，以13 000 r/min于Eppendorf 5418型常温离心机离心5 min，弃除上清液，加入样本稀释液50 μL进行吹打重悬，重悬液放入超声核酸提取仪(购自上海仁度生物科技有限公司)中超声处理15 min。配制扩增检测液：pH 8.1 Tris-HCl缓冲液40 mmol/L，氯化钠25 mmol/L，氯化镁8 mmol/L，二硫苏糖醇5 mmol/L，亚精胺2 mmol/L，牛血清白蛋白80 μg/mL，dATP、dCTP、dGTP和dTTP各0.2 mmol/L，ATP、CTP、GTP和 UTP各1 mmol/L，探针和上游、下游引物终浓度均为0.5 mmol/L，总体积30 μL。处理待检菌株时，将活的偶发分枝杆菌作为阳性对照，无菌水作为阴性对照进行同步处理。超声处理后，吸取样本2 μL，加入扩增检测液中，于PCR仪上运行程序：60 ℃ 10 min，42 ℃ 5 min，同时42 ℃预热酶液(含T7 RNA转录酶和M-MLV各2 000 U)。预热结束后，向反应体系中加入10 μL酶液，混匀后立刻放入实时荧光定量PCR仪中，运行程序：42 ℃ 1 min × 40 cycle；荧光信号收集：1次/min(共40次)，通道为FAM。检测时间为阈值线与样本曲线交点的横坐标，扩增阳性样本为检测时间在40 min内的。RNA恒温扩增曲线结果为阳性的判定为偶发分枝杆菌；扩增曲线结果为阴性的判定为非偶发分枝杆菌。全程检测时间约2 h。检测试剂购自上海仁度生物科技有限公司。

1.2.2 RIARD-MF灵敏度检测 准备透明玻璃磨菌瓶，加入玻璃磨菌珠盖过玻璃管底，加入适量的生理盐水，刮取生长于Middlebrook 7H10培养基上的偶发分枝杆菌至生理盐水中，拧紧磨菌瓶，于涡旋振荡器上震荡磨菌，磨匀后，采用BD PhoenixSpec Nephelometer 440910比浊仪(购自美国碧迪公司)继续用生理盐水将菌液浊度比浊至1 mg/mL。此后用生理盐水进行10倍倍比梯度稀释，稀释浓度分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mg/mL，采用RIARD-MF法对每个稀释梯度的菌悬液进行检测，另在Middlebrook 7H10培养基上进行接种，接种量为每个稀释梯度菌悬液100 μL，于37 ℃隔水式恒温培养箱中恒温培养2至4周后，记录菌落生长数。

1.2.3 RIARD-MF特异度检测 将20种分枝杆菌标准株和5种呼吸道非分枝杆菌培养至对数期，分别收集它们的阳性培养物，并按上述方法磨菌比浊至浊度为1 mg/mL，采用RIARD-MF法分别对其进行检测。

1.2.4 RIARD-MF法鉴别临床分枝杆菌分离株 将259株临床分枝杆菌分离株进行培养，采用RIARD-MF法分别检测其阳性培养物。

1.2.5 PCR基因测序 对待检测临床分离菌株的hsp65及16S rRNA基因进行PCR扩增并完成基因测序，扩增hsp65基因上游引物序列(5′→3′)：ATCGCCAAGGAGATCGAGCT，下游引物序列(5′→3′)：AAGGTGCCGCGGATCTTGTT[5]；扩增16S rRNA基因上游引物序列(5′→3′)：TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG，下游引物序列(5′→3′)：TACCGCGGCTGCTGGCAC[6]。反应体系的配制按照PrimeStar PCR反应试剂盒说明，模板DNA量为10 ng，上游、下游引物的浓度皆为0.5 μmol/L。反应程序：98 ℃ 10 s，hsp65基因退火温度：61 ℃ 10 s；16S rRNA基因退火温度：60 ℃ 10 s，72 ℃ 45 s，× 30 cycle。反应结束后，通过琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行电泳检测，扩增成功的PCR产物送华大基因进行基因测序。经Blast在线比对对测序结果进行同源性分析，以此鉴别出不同菌种。

2 结 果

2.1 RIARD-MF灵敏度检测结果 RIARD-MF检测偶发分枝杆菌的梯度稀释液结果显示，当菌液浓度≥1×10-5mg/mL时，样本检测为阳性。在接种了100 μL 1×10-5mg/mL浓度菌悬液的Middlebrook 7H10培养基中，其菌落生长数平均为6个，故灵敏度可达60 CFU/mL(见图1)。

1:1 mg/mL; 2: 10-1 mg/mL; 3: 10-2 mg/mL; 4: 10-3 mg/mL; 5: 10-4 mg/mL; 6: 10-5 mg/mL; 7: 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 mg/mL and negative control.图1 RIARD-MF检测偶发分枝杆菌灵敏度检测图Fig.1 Sensitivity of RIARD-MF on identification and detection for M. fortuitum

2.2 RIARD-MF法特异度检测结果 5种非分枝杆菌和20种分枝杆菌标准株的检测结果如下：只有偶发分枝杆菌阳性，其他细菌均为阴性，特异度可达100%(见图2)。

1: M. fortuitum; 2: the other 19 species of Mycobacterium except for M. fortuitum and 5 species of non-Mycobacterium.图2 RIARD-MF检测偶发分枝杆菌特异度检测图Fig.2 Specificity of RIARD-MF on identification and detection for M. fortuitum

2.3 RIARD-MF鉴定分枝杆菌临床分离株结果 对259株临床分离菌株进行RIARD-MF检测，结果显示：5株为偶发分枝杆菌，其他254株分枝杆菌检测为阴性。对检测结果为阳性的5株进行PCR基因测序，结果表明其为偶发分枝杆菌，其余254株PCR基因测序鉴定结果如下：82株胞内分枝杆菌，7株戈登分枝杆菌，43株结核分枝杆菌，21株马赛分枝杆菌，8株鸟分枝杆菌，53株脓肿分枝杆菌，13株金色分枝杆菌，5株海分枝杆菌，4株堪萨斯分枝杆菌，副偶发分枝杆菌M.colombiense、M.marseillense和M.bolletii各两株，中庸分枝杆菌、外来分枝杆菌、土分枝杆菌、慢性黄分枝杆菌、M.kumamotonense、M.engbekii、M.algericum、瘰疬分枝杆菌、龟分枝杆菌、耻垢分枝杆菌各1株。以PCR基因测序的结果作为参考标准，对RIARD-MF法检测偶发分枝杆菌的特异度、灵敏度、阳性及阴性预测值分别进行计算，结果依次为100%(254/254)、100%(5/5)、100%(5/5)、100%(254/254)，kappa值为1(表1)。

表1 259株分枝杆菌RIARD-MF鉴定结果
Tab.1 RIARD-MF identification and detection of 259 mycobacterial strains

RIARD-MF基因测序Genesequencing偶发分枝杆菌M.fortuitum其他分枝杆菌Othermycobacteria偶发分枝杆菌M.fortuitum50其他分枝杆菌Othermycobacteria0254

3 讨 论

偶发分枝杆菌属于常见的致病性NTM[7]，1938年由Costa Cruz命名，我国首次报道偶发分枝杆菌是由该菌引起的败血症[8]。近年来全球感染偶发分枝杆菌的病例报道逐渐增加[9]。Hadjiliadis[10]等报道的20例老年NTM患者当中，有14例为偶发分枝杆菌引起的肺炎。Esteban[11]等报道了在马德里地区的28例NTM感染病例中，偶发分枝杆菌感染患者占10例。Lai[12]等报道了2000年至2008年台湾地区的偶发分枝杆菌在致病的NTM中占13.0%，仅次于胞内分枝杆菌和脓肿分枝杆菌。Umrao[13]等对2013年至2015年间的263株临床分离NTM的鉴定显示，偶发分枝杆菌占22%，所占比例仅次于第一位的脓肿分枝杆菌。据估计至今每一百万人之间，就有4到6例偶发分枝杆菌感染患者[14]。偶发分枝杆菌可以引起皮肤感染、肺部病变、淋巴结炎和眼部感染[15]，此外它还趋向侵犯医源性创伤或注射部位而引起的院内感染。1998年福建省南平市樟湖镇某诊所由于医疗器具消毒不严格导致暴发偶发分支杆菌感染59例[16]。偶发分枝杆菌感染已成为一种重要的NTM感染疾病，因此，快速并准确的菌种鉴定对早期诊断偶发分枝杆菌疾病、正确指导临床用药和流行情况监测具有重要意义。

在传统的生化鉴定NTM的方法中，偶发分枝杆菌在芳基硫酸酯酶试验、铁的吸收试验和NaCl的耐受性试验中均呈阳性反应，但是生化检测方法繁琐复杂、耗时，并且试验结果只能说明偶发分枝杆菌的一些表型特性，并不能精确区分NTM的种类。分枝菌酸的高效液相色谱法虽然能在一次试验中快速准确的鉴定偶发分枝杆菌，但是所需设备较昂贵不易普及[17-19]。PCR和限制性内切酶分析(PCR and restriction endonuclease analysis，PRA)虽能快速鉴定偶发分枝杆菌，但其操作过程较为复杂[19]。以DNA为检测靶标的NTM分子鉴定方法多数需通过PCR仪扩增后进行检测[20-24]，不恰当的操作容易在实验室内引发交叉污染，导致假阳性结果的产生，使得临床相关性变差；此外对于作为分子检测金标准的PCR基因测序，在检测含有混合菌株的临床标本时，其基因测序结果存在一定的不准确性，因此要获得准确的鉴定结果需要运用特异性探针的方法来检测。

RIARD技术是一项以RNA为检测靶标的新技术，针对活的分枝杆菌进行检测，不受死菌的干扰，且其特异度和灵敏度都较高，操作简便。使用该技术检测临床痰标本中的结核分枝杆菌其检测灵敏度和特异度分别为94.8%和97.5%[25]；检测临床分离株中的鸟分枝杆菌灵敏度和特异度均为100%[2]。RIARD技术不但拥有同DNA核酸分子检测技术相同的高特异度和高灵敏度的特点，其还具有反应稳定且低污染的优势，因此该技术被应用于多种病原体的检测。

本研究运用RIARD技术，将偶发分枝杆菌的16S rRNA特异序列作为检测靶标，构建RIARD检测鉴定偶发分枝杆菌的检测体系。方法学研究显示，RIARD-MF具有较高的检测灵敏度，可以检测到样本中较低浓度的偶发分枝杆菌活菌；能够特异的区分偶发分枝杆菌和其他19种分枝杆菌以及呼吸道常见致病普通细菌，显示出较该方法具有非常高的特异度。在259株临床分离株的初步验证评估中，鉴定偶发分枝杆菌的灵敏度和特异度均可达100%，显示出该方法用于临床分离株中偶发分枝杆菌快速检测鉴定的优势。基于该方法较高的方法学灵敏度也提示该方法可通过进一步的研究优化，有望用于临床样本中偶发分枝杆菌的直接检测。

本研究建立的RIARD-MF方法，其检测准确、快速，用一般实验室常规配备的实时定量PCR仪即可进行检测。该方法具有直接应用到临床分离株中的偶发分枝杆菌鉴定的检测潜力，有望成为一种新型鉴定偶发分枝杆菌的分子鉴定方法。

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RapididentificationforMycobacteriumfortuitumwithRNAisothermaltranscription-mediatedamplificationandreal-timedetectionassay

PANG Wen-hui1,2, LI Yuan-yuan2, HU Zhong-yi2, FAN Lin2, ZHAO Yang-guo1, CUI Zhen-ling2

(1.SchoolofEnvironmentalScienceandEngineering,OceanUniversityofChina,Qingdao266100,China; 2.ShanghaiKeyLaboratoryofTuberculosis,ShanghaiPulmonaryHospital,TongjiUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200433,China)

The aim of the study is to establish and evaluate a RNA isothermal transcription-mediated amplification and real-time detection assay (RIARD-MF) for the identification ofMycobacteriumfortuitumin clinical isolates. RNA probes and specific primers of reverse transcription and amplification for T7 promoter were designed based on the sequence ofM.fortuitum16S rRNA. The isothermal successive cycles of amplification were performed for real-time detection by using T7 RNA polymerase at 42 ℃. Five non-mycobacteriumstrains, 20Mycobacteriumstrains and 259 clinical strains were detected by the established assay to evaluate the specificity and sensitivity, and the results were compared with those of PCR sequencing. In the test of 5 non-mycobacteriumstrains and 20Mycobacteriumstrains, onlyM.fortuitumwas positive, and the remaining 24 strains of bacteria were negative, which was consistent with PCR gene sequencing. The sensitivity and specificity of RIARD-MF reached 60 CFU/mL and 100%. In the test of 259 strains of clinical isolates, 5 strains were identified to beM.fortuitum, the remaining 254 strains were not identified to beM.Fortuitum, which was also consistent with PCR gene sequencing. Both the specificity and sensitivity reached up to 100% in the detection of clinical isolates. It suggested that the RIARD-MF established in this study is a specific, sensitive, accurate and rapid method for the identification ofM.Fortuitumand it may be hopeful for rapid identification ofM.fortuitumin clinical isolates.

RNA isothermal amplification; identification;MycobacteriumfortuitumFunded by the National Twelfth Five-year Major Subject of Infectious Diseases (No. 2013ZX10003001-003) and the Shanghai Municipal Natural Science Foundation (No. 17ZR1423400)

Cui Zhen-ling, Email:cuizhenling@163.com

国家十二五传染病重大专项课题 (2013ZX10003001-003)；上海市自然基金课题(17ZR1423400)

崔振玲，Email: cuizhenling@163.com

1.中国海洋大学环境科学与工程学院，青岛 266100； 2.同济大学附属上海市肺科医院/上海市结核病(肺)重点实验室，上海 200433

R378.91

：A

：1002-2694(2017)09-0763-05

2017-02-23编辑：张智芳