禽流感病毒H7N9神经氨酸酶的优势线性B细胞抗原位点的预测及确定

高孟 谢珲 姜立民 高丽美 倪红霞 罗永能

310013 杭州，浙江省医学科学院病毒病研究所(高孟、谢珲、姜立民、高丽美、罗永能)；315010 宁波市疾病预防控制中心病毒研究所(倪红霞)

·论著·

禽流感病毒H7N9神经氨酸酶的优势线性B细胞抗原位点的预测及确定

高孟 谢珲 姜立民 高丽美 倪红霞 罗永能

310013 杭州，浙江省医学科学院病毒病研究所(高孟、谢珲、姜立民、高丽美、罗永能)；315010 宁波市疾病预防控制中心病毒研究所(倪红霞)

目的确定禽流感病毒H7N9神经氨酸酶的优势线性B细胞抗原位点。方法利用生物信息学软件DNAStar中的Protean程序分析禽流感病毒H7N9神经氨酸酶氨基酸序列的亲水性、抗原性和表面可及性，计算不同区段上述指数的加权平均值，预测出潜在的优势线性B细胞抗原位点并进行人工合成。利用多肽-酶联免疫吸附试验(多肽-ELISA)检测各预测片段与明确感染H7N9患者血清的反应性，同时以未感染H7N9的正常人血清作为阴性对照。结果根据抗原性、亲水性和表面可及性指数均较高的特点，共预测出7个潜在的神经氨酸酶线性B细胞抗原位点，分别为A、B、 C、D、 E、F和 G多肽-ELISA实验结果证实各预测表位均与H7N9患者血清发生阳性反应。结论成功预测及确定了禽流感病毒H7N9神经氨酸酶优势线性B细胞抗原位点，为抗原分子特异性研究和抗体制备奠定了基础。

流行性感冒病毒(简称流感病毒)为RNA病毒的正粘病毒科流感病毒属成员，根据病毒核蛋白和基质蛋白抗原性的差异可将其分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，其中A型流感病毒的感染范围最广、危害最大。禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)属于A型流感病毒，可感染多种动物和人。根据流感病毒血凝素(Hemagglutinin, HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase, NA)的抗原性不同可将流感病毒分成不同亚型，其中HA有16种抗原型，NA有9种抗原型，不同的HA和NA组成不同的病毒亚型[1-3]。神经氨酸酶NA是一种糖蛋白，构成病毒囊膜纤突的重要成分，能够水解糖末端的唾液酸残基，使病毒颗粒从宿主细胞受体上释放，有利于新生子代病毒离开细胞进行传播[4-5]。新型H7N9是近年暴发的感染人的禽流感病毒亚型，神经氨酸酶N9是该病毒第二个重要的表面抗原，探索其抗原分子特异性和免疫原性，对该流行病的预防和诊断具有重要意义。

抗原表位或抗原决定簇是决定抗原或免疫原分子特异性的特殊化学基团，根据免疫应答所识别淋巴细胞的不同可相应分为T细胞抗原表位和B细胞抗原表位，分别与T细胞和B细胞表面的抗原受体结合。其中B细胞抗原表位包括构象性表位(序列上不相连、但在空间结构上相互临近)和线性表位(序列上相连)，由于构象性表位相对复杂，目前表位预测主要针对线性表位，一般根据抗原性、亲水性和表面可及性指数高的特点来进行预测。

本研究利用生物信息学软件预测了H7N9神经氨酸酶N9的线性B细胞抗原表位，人工合成多肽后利用多肽-ELISA检测各预测片段与明确感染H7N9患者血清的反应性，确定阳性反应强烈的多肽片段为N9的优势线性B细胞抗原表位，可进一步用于抗原特异性研究和抗体制备。

1 材料与方法

1.1主要试剂与材料人工合成多肽由南京金斯瑞生物科技有限公司提供；明确感染H7N9患者血清(3份)和未感染正常人血清6份均由绍兴市人民医院临床检验中心和宁波市疾病预防控制中心病毒室提供，确诊依据为H7N9病毒核酸检测阳性和临床症状等；HRP标记的羊抗人IgG抗体和TMB显色液均购自北京康为世纪；96孔酶标板购自Costar公司。

1.2H7N9神经氨酸酶线性B细胞抗原位点预测从GenBank上下载H7N9禽流感病毒浙江株神经氨酸酶N9氨基酸序列(GenBank: KC885956)，用生物信息学软件DNAStar中的Protean程序分析该序列的抗原性、亲水性和表面可及性，计算各指数的加权平均值，以3者数值均较高为原则预测出潜在的线性B细胞抗原表位，选取相应的多肽片段进行人工合成。

1.3多肽-酶联免疫吸附试验检测取人工合成多肽作为抗原，以明确感染H7N9的患者血清作为一抗、羊抗人IgG抗体作为二抗检测人工合成的多肽与患者血清中抗体的反应性，同时以正常人血清作为阴性对照。用包被液稀释多肽至10 μg/ml，100 μl/孔包被于96孔酶标板，4 ℃反应过夜后洗板3次；每孔加入200 μl含1%牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲溶液(PBST)进行封闭，37 ℃孵育1 h后洗板3次；用封闭液将血清样品稀释100倍后加入各反应孔，100 μl/孔，同时利用封闭液和阴性血清设立空白对照和阴性对照，37 ℃孵育1 h后洗涤5次；将HRP标记的羊抗人IgG 进行1∶5 000稀释后加入反应孔，100 μl/孔，37 ℃孵育30 min后洗涤5次；每孔加入100 μl TMB显色液，37 ℃避光反应15 min后加入50 μl 2 mol/L硫酸终止反应，用酶标仪测定450 nm的吸光度值。按通用的判断标准，以阴性对照孔的平均吸光度值的2.1倍为阈值判定阴阳性。

2 结果

2.1H7N9神经氨酸酶线性B细胞抗原位点预测结果通过DNAStar中的Protean程序分析，禽流感病毒H7N9神经氨酸酶氨基酸序列的抗原性、亲水性和表面可及性结果见图1。

A、B、C、D、E、F和G: 潜在的H7N9神经氨酸酶(即N9)蛋白的线性B细胞抗原位点图1 H7N9神经氨酸酶(即N9)氨基酸序列的抗原性、亲水性和表面可及性性分析结果A, B, C, D, E, F and G: Potential immunodominant linear B cell epitopes in neuraminidase of H7N9Fig.1 Antigenicity, hydrophilicity and surface probability analysis of amino acid sequences in neuraminidase of avian influenza virus H7N9

计算上述各片段的抗原性、亲水性和表面可及性的加权平均值，依据从强原则，选取3者指数均较高的多肽区段判定为潜在的线性B细胞抗原表位，各预测位点的参数值见表1。

表1 H7N9神经氨酸酶蛋白线性B细胞抗原位点的预测结果

2.2多肽-ELISA检测各线性B细胞抗原位点的免疫显性人工合成上述预测的7个多肽片段，用多肽-ELISA检测各片段与明确感染H7N9患者血清的反应情况，同时以正常人血清作为阴性血清，结果如图2所示。7个多肽片段均与患者阳性血清发生阳性反应，OD值均大于阴性对照的2.1倍，但各多肽与患者血清的反应程度存在差异。

图2 H7N9神经氨酸酶潜在的线性B细胞抗原表位与患者血清的peptide-ELISA结果Fig.2 Peptide-ELISA results of potential linear B cell epitopes in neuraminidase of H7N9 with human sera

通过与已测定的H7N9神经氨酸酶的晶体三维结构(PDB：4MWJ)[6]对比分析发现，上述抗原表位C的部分片段和表位D、E、F、G均位于N9的蛋白表面，与抗原表位位于蛋白表面的特点相符(图3)。

注：partial C、D、E、F、G为预测的优势线性B细胞抗原决定簇位点图3 预测的优势线性B细胞抗原表位在H7N9神经氨酸酶蛋白中的分布情况(PDB：4MWJ)Fig.3 Distribution of predicted immunodominant linear B cell epitopes in neuraminidase of H7N9 (PDB: 4MWJ)partial C、D、E、F和G：潜在的优势线性B细胞抗原表位partial C, D, E, F and G: Potential immunodominant linear B cell epitopes in neuraminidase of H7N9

3 讨论

H7N9禽流感病毒自2013年3月在我国暴发以来引起了全球的广泛关注，这种在禽类身上呈现低致病性的亚型，可导致人类严重感染，甚至死亡[7-10]。H7N9禽流感病毒感染人类一般表现为流感样症状，如发热、咳嗽、头痛和肌肉酸痛。重症者病情发展迅速，多在3～5 d内出现重症肺炎，甚至伴有多器官功能衰竭等。禽流感病毒内部基因的高突变率以及耐药毒株的出现表明该病毒可能进一步扩散引起大流行，因此必须建立针对性的有的防控机制和诊疗手段[11-12]。神经氨酸酶N9是H7N9第二个重要的表面抗原，对其线性抗原表位的预测有助于进一步分析H7N9的抗原分子特异性，为研制诊断试剂和疫苗奠定了基础。

此前，刘雪婷等[13]预测了H7N9禽流感病毒HA、NA蛋白的抗原表位并分析其与HLA-II类等位基因的相关性，其中位于NA蛋白的B细胞表位12个，但未用实验证明预测片段是否与自然感染的阳性血清发生阳性反应；李虎等[14]利用Protean、PORTER、MEGA等多种生物信息学软件同时结合吴玉章的平均抗原指数方案综合预测了H7N9禽流感病毒HA、NA蛋白潜在的B细胞表位，为表位疫苗的制备提供了实验基础，但其预测的多肽片段长度较短，并且未用实验验证各片段是否与阳性血清反应，其多肽位点的抗原性有待进一步确认。于悦洋等[15]利用传统的杂交瘤技术制备获得了3株抗H7N9禽流感病毒NA的小鼠单克隆抗体1G8、3C4和4E8，它们都能结合N9蛋白但识别的抗原表位不同，其中3C4和4E8能抑制神经氨酸酶活性。

我们已经利用生物学软件成功预测并确定了肠道病毒71型与柯萨奇病毒A16型衣壳蛋白VP1～VP3、H7N9禽流感病毒血凝素和新型布尼亚病毒核衣壳蛋白的优势线性B细胞抗原决定簇[16-21]。本研究采用相同方法共获得7个H7N9禽流感病毒神经氨酸酶的优势线性B细胞抗原表位，多肽-ELISA方法证实各预测表位均能与H7N9患者血清发生阳性反应，但反应强度有差异，这可能与不同多肽表位的氨基酸序列、二级结构及其在NA蛋白或病毒颗粒三维结构中的空间构象等诸多因素所导致的抗原性/免疫原性差异有关。另外，由于Wu等[6]测定了蛋白晶体三维结构并保存于蛋白结构数据库(PDB)中的H7N9神经氨酸酶并非全长，其未包含N端的部分氨基酸序列，故而据此只能确定抗原表位C的部分片段和表位D、E、F、G均位于N9的蛋白表面。目前，对于禽流感病毒H7N9神经氨酸酶的研究多集中在抗原表位预测和分子特异性方面，下一步我们将选取特异性最佳的优势抗原多肽进行抗体制备，进一步建立神经氨酸酶N9的免疫学检测方法。

[1] Webster RG, Bean WJ, Gorman OT, et al. Evolution and ecology of influenza A viruses[J]. Microbiol Rev, 1992, 56(1): 152-179.

[2] 殷震, 刘景华. 动物病毒学 [M]. 北京: 科学出版社, 1997.

[3] Fouchier RA, Munster V, Wallensten A, et al. Characterization of a novel influenza A virus hemagglutinin subtype (H16) obtained from black-headed gulls[J]. J Virol, 2005, 79(5):2814-2822. doi: 10.1128/JVI.79.5.2814-2822.2005.

[4] Colman PM. Influenza virus neuraminidase: structure, antibodies, and inhibitors[J]. Protein Sci, 1994, 3(10): 1687-1696. doi: 10.1002/pro.5560031007.

[5] Su B, Wurtzer S, Rameix-Welti MA, et al. Enhancement of the influenza A hemagglutinin (HA)-mediated cell-cell fusion and virus entry by the viral neuraminidase (NA)[J]. PloS One, 2009, 4(12): e8495. doi: 10.1371/journal.pone.0008495.

[6] Wu Y, Bi Y, Vavricka CJ, et al. Characterization of two distinct neuraminidases from avian-origin human-infecting H7N9 influenza viruses[J]. Cell Res, 2013, 23(12):1347-1355. doi: 10.1038/cr.2013.144.

[7] 姜慧芬, 罗永能, 姜立民. 人感染H7N9禽流感的流行特征[J]. 中华医院感染学杂志, 2015, 25(3):629-631.

[8] Gao R, Cao B, Hu Y, et al. Human infection with a novel avian-origin influenza A (H7N9) virus[J]. N Engl J Med, 2013, 368(20):1888-1897. doi: 10.1056/NEJMoa1304459.

[9] Chen Y, Liang W, Yang S, et al. Human infections with emerging avian influenza A H7N9 virus from wet market poultry: clinical analysis and charactersation of viral genome[J]. Lancet, 2013, 381(9881):1916-1925. doi: 10.1016/S0140-6736(13)60903-4.

[10] 刘曦, 袁静, 杨争, 等. 深圳24例H7N9患者合并细菌感染危险因素分析[J]. 中华实验和临床病毒学杂志, 2016, 30(2):179-181.doi: 10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.017.

[11] 魏燕楠, 张超, 陈勍, 等. H7N9禽流感病毒野生或突变神经氨酸酶对奥司他韦及扎那米韦敏感性的研究[J]. 病毒学报, 2014, 30(4):396-401. doi: 10.13242/j.cnki.bingduxuebao.002522.

[12] 董婕, 高荣保, 董丽波, 等. Peramivir体外抗禽流感H7N9病毒有效性研究[J]. 中华实验和临床病毒学杂志, 2015, 29(1):26-28. doi: 10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2015.01.009.

[13] 刘雪婷, 王珊, 张俊艳, 等. H7N9流感病毒HA、NA蛋白的抗原表位预测及其与HLA-Ⅱ类等位基因的相关性分析[J]. 中国免疫学杂志, 2015, 31(1):16-21. doi: 10.3969/j.issn.1000-484X.2015.01.003.

[14] 李虎, 胡鹏. 人感染H7N9禽流感病毒血凝素和神经氨酸酶的B细胞表位预测[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2013, 29(12):1319-1321+1326. doi: 10.13423/j.cnki.cjcmi.006878.

[15] 于悦洋, 谢怡然, 陈迎珠, 等. 抗H7N9亚型流感病毒神经氨酸酶单克隆抗体的制备及初步鉴定[J]. 中华实验和临床病毒学杂志, 2017,31(01):66-70. doi: 10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.01.014.

[16] 高丽美, 高孟, 王静华, 等. 肠道病毒71型H3-TY株衣壳蛋白VP1～VP3的优势线性B细胞抗原决定簇预测与确定[J]. 中国卫生检验杂志, 2014, 24 (22):3193-3195.

[17] 张锋, 朱莲, 陈军, 等. 柯萨奇病毒A16型YY157株在Vero细胞中培养与增殖特性的研究[J]. 中华实验和临床病毒学杂志, 2014, 28(6):446-448. doi: 10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2014.06.015.

[18] 高孟, 倪红霞, 朱莲, 等. 柯萨奇病毒A16型衣壳蛋白VP1～VP3的B淋巴细胞线性抗原表位预测与确定[J]. 中华临床感染病杂志, 2015, 80(6):543-548. doi: 10.3760/cma.j.issn.1674-2397.2015.06.007.

[19] 陶薇, 高孟, 姜立民, 等. 人感染H7N9禽流感病毒血凝素蛋白线性B淋巴细胞抗原表位的预测及鉴定等[J]. 中华临床感染病杂志, 2016, 9(4):336-341, 348. doi: 10.3760/cma.j.issn.1674-2397.2016.04.010.

[20] 陈军, 孙培蓓, 张锋, 等. 发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒核衣壳蛋白线性B细胞抗原决定簇的预测与确定[J]. 病毒学报, 2016, 32(5):597-602.doi: 10.13242/j.cnki.bingduxuebao.003007.

[21] 蔡静, 罗永能. 肠道病毒71型衣壳蛋白的抗原表位及其单克隆抗体[J]. 国际流行病学传染病学杂志, 2017, 44(2):126-130. doi: 10.3760/cma.j.issn.1673-4149.2017.02.012.

PredictionandidentificationofimmunodominantlinearBcellepitopesinN9ofavianinfluenzavirusH7N9

GaoMeng,XieHui,JiangLimin,GaoLimei,NiHongxia,LuoYongneng
InstituteofViralDiseases,ZhejiangAcademyofMedicalSciences,Hangzhou310013,China(GaoM,XieH,JiangLM，GaoLM,LuoYN);NingboCenterforDiseaseControlandPrevention，Ningbo310010，China(NiHX)Correspondingauthor:LuoYongneng,Email:ynl101@163.com

ObjectiveTo identify immunodominant linear B cell epitopes in neuraminidase of avian influenza virus H7N9.MethodsBy using protean algorithms of bioinformatic software DNAStar, antigenicity, hydrophilicity and surface probability of the H7N9 neuraminidase sequence was analyzed and their corresponding average indexes were calculated. Multiple regions containing potential linear B cell epitopes were predicted. Corresponding peptides were synthesized artificially and used in peptide-ELISA individually to check their reactivity to confirmed H7N9 positive human sera, and H7N9 negative human sera was used as control.ResultsSeven potential linear B cell epitopes, namely A to G, were predicted according to their relatively strong antigenicity, hydrophilicity and surface probability. All corresponding synthetic peptides reacted strongly with H7N9 positive sera.ConclusionsImmunodominant linear B cell epitopes in neuraminidase of H7N9 were successfully predicted and confirmed. It will facilitate to clarify molecular basis of the antigen specificity and to make respective antibodies.

Influenza A virus; Linear B cell epitope; Peptide enzyme-linked immunosorbent assay

流感病毒A型；线性B细胞抗原位点；多肽-酶联免疫吸附测定

2016-02-01)

(本文编辑：陈培莉)

罗永能，Email：ynl101@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.04.002

浙江省医药卫生科技计划(2014KYA039)；浙江省重点实验室科技计划(2008F3022)

Fundprograms: Medical and Health Research Programs of Zhejiang Province (2014KYA039);Scientific Projects for Zhejiang Provincial Key Laboratories (2008F3022)