HBx和HSF1对肝癌HepG2细胞生长的影响

张智 郭鹏 孙兴 肖艺 徐静 彭涛 赵国良 吴曙粤 黄海

作者单位：530022 南宁 1南宁市第一人民医院肝胆胰腺外科；530021 南宁 2广西医科大学附属口腔医院口腔外科；530021 南宁 3广西医科大学第一附属医院肝胆外科；530022 南宁 4南宁市第一人民医院儿科

Zhang Zhi1，Guo Peng2，Sun Xing1，Xiao Yi1，Xu Jing3，Peng Tao3，Zhao Guoliang3，Wu Shuyue4，Huang Hai1

（1Department of Hepatobiliary and pancreas Surgery,the First People's Hospital of Nanning，Nanning 530022，P.R.China；2Department of the Dental Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China；3Department of Hepatobiliary Surgery,the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China；4Department of Pediatrics，the First People's Hospital of Nannin，Nanning 530022，P.R.China）

基础研究

HBx和HSF1对肝癌HepG2细胞生长的影响

张智1郭鹏2孙兴1肖艺1徐静3彭涛3赵国良3吴曙粤4黄海1

作者单位：530022 南宁1南宁市第一人民医院肝胆胰腺外科；530021 南宁2广西医科大学附属口腔医院口腔外科；530021 南宁3广西医科大学第一附属医院肝胆外科；530022 南宁4南宁市第一人民医院儿科

目的探讨过表达乙型肝炎病毒X基因（hepatitis B virus X gene，HBx）上调热休克转录因子1（heat shock transcription factor 1，HSF1）对肝癌HepG2细胞生长的影响。方法通过pcDNA3.1载体与HBx基因连接构建pcDNA3.1-HBx过表达质粒，同时构建空载体pcDNA3.1对照质粒，采用脂质体介导转染肝癌HepG2细胞，获得Mock/HepG2细胞（对照组）和HBx/HepG2细胞（实验组）。采用Western blot技术检测细胞内HSF1和HBx蛋白表达水平，MTT实验、平板克隆形成实验、划痕实验和Transwell实验观察细胞生长情况。结果与转染空载体pcDNA3.1的Mock/HepG2细胞相比，转染过表达载体pcDNA3.1-HBx的HBx/HepG2细胞中HBx和HSF1蛋白表达明显增加；细胞平板克隆形成［（46.13±1.25%vs 86.43±1.01%）］、侵袭能力［（22.47±2.05）%vs（51.01±1.75）%］和迁移能力［（24.18±0.98）%vs（59.03±0.83）%］明显增强，差异有统计学意义（P<0.05）。结论HBx基因可上调肝癌HepG2细胞HSF1和HBx蛋白的表达，促进细胞增殖、侵袭和迁移，导致细胞恶性生长。

肝肿瘤；乙型肝炎病毒X基因；热休克转录因子1；肝癌HepG2细胞；细胞生长

肝癌是常见的恶性肿瘤，发病隐匿、发展迅速、病死率高，预后较差［1］。即使早期手术切除小肝癌，5年内转移复发率仍高达50%［2］。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）慢性感染是促进肝癌形成的主要因素。研究表明，乙型肝炎病毒X基因（hepatitis B virus X gene，HBx）的表达产物一方面参与病毒自身的复制过程，另一方面通过直接或间接的蛋白质之间的相互作用影响宿主细胞内信号转导、细胞凋亡、细胞周期调控等多种生物学过程，从而促进肝癌发生发展［3］。研究表明，热休克转录因子1（heat shock transcription factor 1，HSF1）基因是调控热休克蛋白（heat shock protein，HSP）表达的重要因子，调控多种基因的表达［4］，与肝癌发生发展有关［5］。

本研究通过瞬转法构建HBx过表达HepG2肝癌细胞，通过Western blot实验检测HSF1和HBx两种蛋白在细胞中的表达水平，MTT实验、平板克隆形成实验、划痕实验和Transwell实验观察细胞生长情况，探讨HSF1和HBx相互作用对肝癌生物学行为的影响，以期为临床肝癌治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料

肝癌细胞系HepG2购自中国科学院上海细胞库。特异性HBx抗体购自美国Abcam公司，鼠抗人HSF1抗体、β-actin抗体购自美国Santa Cruz公司，DMEM、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国Gibco公司，Matrigel购自美国BD公司，脂质体（Lipofectamine 2000）购自美国Invitrogen公司，Transwell小室购自美国Millipore公司，ECL显色剂购自北京中杉生物技术有限公司，MTT试剂盒和BCA蛋白试剂盒购自中国碧云天生物公司。

1.2 细胞培养

肝癌HepG2细胞培养于含10%FBS的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2一定饱和湿度环境条件下连续培养，倒置显微镜观察细胞形态。

1.3 载体构建和瞬时转染肝癌HepG2细胞

设计含有EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切位点引物，扩增并获得全长HBx基因片段，经酶切和连接反应插入pcDNA3.1载体，构建过表达HBx的pcDNA3.1-HBx载体。试剂盒提取质粒，行双酶切和电泳鉴定测序。用脂质体转染法将过表达载体pcDNA3.1-HBx和空载体pcDNA3.1瞬时转染肝癌HepG2细胞，获得Mock/HepG2细胞（对照组）和HBx/HepG2细胞（实验组）。

1.4 Western blot实验检测HSF1和HBx蛋白的表达

常规培养Mock/HepG2细胞和HBx/HepG2细胞，待密度长至85%～95%，胰酶消化细胞，用1×PBS洗涤，3 000 r/min离心5 min，弃上清液，收集细胞。加入50 μL细胞裂解液和0.2 μL PMSF，冰上裂解30 min。4℃12 000 r/min离心15 min，收集上清液，用BCA法测定细胞总蛋白浓度。根据测得浓度，每孔上样25 g蛋白，加入蛋白上样缓冲液，煮沸5 min。上样至10%SDS-PAGE凝胶，80V电泳30 min，转120V电泳90 min，取出凝胶于4℃转印2 h至PVDF膜；5%牛奶室温封闭PVDF膜1 h，加入HBx或者HSF1抗体（1∶1000），4℃孵育过夜，1×PBST漂洗PVDF膜3次，每次5 min，加入鼠二抗（1∶2 000），室温孵育 2 h，1×PBST 漂洗PVDF膜3次，每次5 min，DAB显色法显色并扫描成像。实验重复3次。

1.5 MTT实验检测细胞增殖情况

常规培养Mock/HepG2细胞和HBx/HepG2细胞，胰酶消化，制成单细胞悬液。细胞分别按1×104个/孔接种于5块96孔板中，同时设置空白对照孔，每24 h取一块96孔板行MTT实验检测。每孔加入10 mL MTT溶液（浓度5 mg/mL），培养箱孵育4 h，加入DMSO溶液150 μL/孔，水平摇床上孵育10 min。酶标仪取490 nm处测定各孔OD值，按以下公式计算细胞增殖抑制率：增殖抑制率=1-（实验孔值-空白孔值）/（对照孔值-空白孔A值）。实验重复3次。

1.6 平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力

取对数生长期的Mock/HepG2和HBx/HepG2细胞，胰酶消化，制成单细胞悬液；取200个细胞分别接种于含10 mL、10%FBS的DMEM皿中，细胞培养箱中培养14 d。弃上清液，PBS洗去残留血清和培养基。加入5 mL甲醇固定细胞5min。去固定液，加适量0.005%龙胆紫染色10 min，流水缓慢漂洗染色液，空气干燥。显微镜计数大于50个细胞的克隆数，计算克隆形成率：克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%。实验重复3次。

1.7 划痕实验检测细胞迁移能力

直尺和Marker笔用紫外线照射30 min。Marker笔在12孔板背后用直尺每隔0.5 cm划横线穿过培养孔，每孔5条。常规培养Mock/HepG2细胞和HBx/HepG2细胞，胰酶消化，制成单细胞悬液，按5×104个/孔接种于12孔板中。约24 h细胞长满后，用20 μL无菌枪头比着直尺，垂直于横线划痕。用1×PBS洗净划痕处残留细胞，加入无血清DMEM，继续培养24 h，倒置显微镜拍照，记录实验结果。实验重复3次。

1.8 Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力

Matrigel基底膜加入无血清DMEM，按1∶8稀释，取100 μL稀释液包被Transwell小室的上室，4℃孵育1 h。取出小室，吸弃培养板中残余液体，每孔加入50 μL无血清DMEM，37℃培养箱孵育30 min。用胰酶消化Mock/HepG2细胞和HBx/HepG2细胞，制成单细胞悬液，调整细胞密度至2×105。Transwell上室加入200 μL细胞悬液，下室加入 500 μL含 0.2%FBS的DMEM。置培养箱继续培养24 h，弃除DMEM培养基，用1×PBS洗去残留培养基，甲醇固定5 min，加入0.1%结晶紫染色5 min，水冲洗干净。随机选取5～8个视野，通过Leica DC 300F倒置显微镜观察和拍照。实验重复3次。

1.9 统计学处理

采用IBM SPSS Statistics 19.0软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，正态分布资料的两组均数比较采用独立样本t检验，计数资料用百分比表示，率的比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HBx和HSF1蛋白在Mock/HepG2和HBx/HepG2细胞中的表达

Western blot实验结果显示，转染pcDNA3.1-HBx载体的HBx/HepG2细胞（实验组）HBx和HSF1蛋白表达量增加，而转染空载体的Mock/HepG2细胞（对照组）中未见HBx蛋白表达，仅见少量HSF1蛋白表达。说明pcDNA3.1-HBx载体成功转染至肝癌HepG2细胞中，目的基因HBx在细胞中成功表达，且促进了HBx和HSF1蛋白表达。见图1。

2.2 细胞生长情况

细胞生长曲线显示，转染pcDNA3.1-HBx载体的HBx/HepG2细胞第3天细胞开始生长，速度较转染空载体的Mock/HepG2细胞明显加快，两者差异有统计学意义（P<0.05），提示HBx基因可促进肝癌HepG2细胞生长。见图2。

图1 Western blot检测HSF1和HBx蛋白的表达

图2 pcDNA3.1-HBx和pcDNA3.1转染后的细胞生长曲线

2.3 细胞克隆形成实验结果

平板克隆形成实验显示，与转染空载体的Mock/HepG2细胞相比，转染pcDNA3.1-HBx载体的HBx/HepG2 细胞克隆形成明显增多［（46.13±1.25）%vs（86.43±1.01）%，P<0.05）］，提示肝癌 HepG2细胞 HBx和HSF1相互作用影响细胞平板克隆形成。见图3。

图3 pcDNA3.1-HBx和pcDNA3.1转染后的细胞平板克隆形成

2.4 细胞划痕实验结果

划痕实验结果显示，划痕24 h后，和转染空载体的Mock/HepG2细胞相比，转染pcDNA3.1-HBx载体的HBx/HepG2细胞在划痕两侧逐渐向中间迁移，愈合速度增快［（24.18±0.98）%vs（59.03±0.83）%，P<0.05］。见图4。

图4 pcDNA3.1-HBx和pcDNA3.1转染后的细胞迁移能力

2.5 Transwell侵袭实验结果

采用覆盖有Matrigel的Transwell小室检测转染后肝癌HepG2细胞的侵袭能力。Transwell实验结果显示，和转染空载体的Mock/HepG2细胞相比，转染pcDNA3.1-HBx载体的HBx/HepG2细胞穿膜细胞数明显增多，侵袭能力增强［（22.47±2.05）%vs（51.01±1.75）%），P<0.05］。见图 5。

图5 pcDNA3.1-HBx和pcDNA3.1转染后的细胞侵袭能力

3 讨论

研究表明肝癌的发生发展是多阶段、多因素、多基因参与的复杂过程［6］。大量证据已证明HBV感染是肝癌的主要病因之一［7］，HBx基因编码的HBx蛋白具有强大的恶性转化能力，可调控多种细胞过程，包括信号转导级联、DNA修复、细胞凋亡和细胞增殖等，可直接诱导肝癌发生，并增加其恶性表型，还与肿瘤预后不良密切相关［8］。Chen等［9］研究发现 HBx可激活Wnt/β-catenin信号通路，上调β-catenin和c-Myc蛋白表达，从而促进肝癌侵袭、转移。Kongkavitoon等［10］研究发现沉默HBx基因可抑制HepG 2.2.15细胞Delta-Like 4/Notch1蛋白表达，其分子机制可能与Notch激活有关。Peng等［11］研究发现HBx和SP1相互作用可直接激活DKK1启动子，促进肝癌侵袭、转移。由此可见，HBx蛋白在肝癌的发生发展过程中起重要作用。

热休克反应（heat shock response，HSR）是一种保护性应激反应，在机体受到缺氧、缺血、过热和炎症等有害刺激时，激活热休克转录因子（heat shock factors，HSFs）可促进热休克蛋白表达，如HSP110、HSP90、HSP70/HSP72、HSP60和HSP27等，保护机体免受蛋白毒性应激而度过病理状态，从而减轻损伤，增加细胞存活能力［12-13］。人类HSFs家族成员包括 HSF1、HSF2和HSF4，其中HSF1是调节细胞应激热休克反应最主要的调控因子，与蛋白折叠、细胞周期DNA修复、转录、翻译、能量代谢等相关［14］。近年的研究发现HSF1不但可增加肿瘤中热休克蛋白的表达，亦可参与调控肿瘤细胞的恶性行为［15］。Ma等［16］研究发现低糖环境可诱导HSF1/S326磷酸化、上调B-crystallin和HSP70蛋白表达，从而促进肝癌细胞增殖。Li等［17］研究发现HSF1可激活MicroRNA-135b，促进SMMC-7721和Huh-7肝癌细胞侵袭转移。Fang等［18］研究发现HSF1在多结节、血管侵犯和缺乏包膜肝癌组织中高表达，与预后不良呈正相关。有研究认为HSF1通过促进细胞增殖、抑制细胞凋亡和抑制抗肿瘤免疫，从而诱导肿瘤发生发展［19］，是肝癌潜在的治疗靶点［20］。上述研究结果表明HSF1与肝癌的发生发展密切相关。因此，了解HSF1在肝癌发生发展中的作用机制，可能有助于肝癌治疗找到新的契机。

Li等［21］研究发现，HBx基因转染的肝癌 HepG2细胞可激活c-Myc而上调HSP90蛋白表达。可见，HBx和热休克蛋白密切相关，但目前尚无HBx蛋白与HSF1关系的相关报道。为研究HBx和HSF1相互作用对肝癌生长的影响，本研究将过表达HBx的pcDNA3.1-HBx载体转染肝癌HepG2细胞，提取蛋白后通过Western blot技术检测HBx和HSF1蛋白的表达。结果显示，肝癌HepG2细胞转入HBx基因后HBx和HSF1蛋白表达量增加，且促进细胞增殖、平板克隆形成、迁移和侵袭能力。因此推测HBx和HSF1不仅与肝癌的发生发展关系密切，而且很可能在肝癌的侵袭转移中发挥作用，但两者发挥协同作用的机制有待进一步研究。

本研究初步发现HBx和HSF1相互作用影响了肝癌细胞生长，这可能是诱发肝癌恶性转化的新机制。但本实验仅做初步研究，还需要进一步深入阐明HBx和HSF1在肝癌发生发展中的分子机制，为肝癌的防治提供新的实验依据。

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［2017-02-28收稿］［2017-04-15修回］［编辑 罗惠予］

Effects of hepatitis B virus X gene on expression of HSF1 and growth in HepG2 human hepatoma cells

ObjectiveTo explore the effects of the hepatitis B virus X gene（HBx）on expression of heat shock transcription factor 1（HSF1）and growth of HepG2 hepatocellular carcinoma cells.MethodsHepG2 cells were transfected with empty pcDNA3.1 vector or pcDNA3.1 encoding HBx using Lipofectamine 2000.After 24 h，the two groups of transfected cells were compared in terms of HSF1 and HBx protein expression（Western blot），MTT assay，plate clone formation，wound healing，and Transwell assay.ResultsHBx and HSF1 proteins were expressed at significantly higher levels in the cells transfected with pcDNA3.1-HBx than in cells transfected with empty vector.Cells transfected with the HBx gene showed significantly greater colony formation（86.43±1.01%vs 46.13±1.25%，P<0.05），invasion （51.01±1.75%vs 22.47±2.05%，P<0.05）and migration （59.03±0.83%vs 24.18±0.98%，P<0.05）.ConclusionTransfecting the HBx gene into HepG2 cells up-regulates expression of HBx and HSF1，which promotes the growth of hepatoma cells.

Liver neoplasm；Hepatitis B virus X（HBx）；Heat shock transcription factor 1（HSF1）；Hepatoma HepG2 cells；Cell growth

Huang Hai.E-mail：nnsyy2016@aliyun.com

R735.7

A

1674-5671（2017）04-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2017.04.12

Zhang Zhi1，Guo Peng2，Sun Xing1，Xiao Yi1，Xu Jing3，Peng Tao3，Zhao Guoliang3，Wu Shuyue4，Huang Hai1

（1Department of Hepatobiliary and pancreas Surgery,the First People's Hospital of Nanning，Nanning 530022，P.R.China；2Department of the Dental Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China；3Department of Hepatobiliary Surgery,the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China；4Department of Pediatrics，the First People's Hospital of Nannin，Nanning 530022，P.R.China）

广西医科大学青年科学基金资助项目（GXMUYSF201542）；南宁市科学研究与技术开发计划资助项目（20163130）

黄海。E-mail：nnsyy2016@aliyun.com