EB病毒microRNA Bart6-5p表达对鼻咽癌上皮间质转化的影响

杨红杰 朱庆尧 雒建超 韩倩

作者单位：450003 郑州 河南省人民医院放疗科

EB病毒microRNA Bart6-5p表达对鼻咽癌上皮间质转化的影响

杨红杰 朱庆尧 雒建超 韩倩

作者单位：450003 郑州 河南省人民医院放疗科

目的探讨EB病毒microRNA Bart6-5p表达对鼻咽癌细胞上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）的影响。方法 采用实时荧光定量PCR检测EB病毒阳性的鼻咽癌细胞株C666-1和淋巴瘤细胞株Akata、Daudi、Raji及Namalwa中microRNA Bart6-5p和Dicer mRNA的表达，在恒定携带EB病毒且microRNA Bart6-5p表达最高的鼻咽癌细胞株C666-1中抑制microRNA Bart6-5p表达后检测Dicer和与鼻咽癌EMT相关分子标志物E-cadherin、Vimentin、ZEB1和ZEB2 mRNA的表达。结果 EB病毒阳性细胞株中microRNA Bart6-5p mRNA表达水平按C666-1、Akata、Daudi、Raji及 Namalwa顺序依次递减（P＜0.05），而 Dicer mRNA 表达水平则依次递增（P＜0.05）。在恒定携带 EB 病毒且microRNA Bart6-5p表达最高鼻咽癌细胞株C666-1中抑制microRNA Bart6-5p表达后，Dicer mRNA表达呈升高趋势（P＜0.05），与鼻咽癌 EMT相关分子标志物E-cadherin mRNA表达呈升高趋势（P＜0.05），Vimentin、ZEB1及ZEB2 mRNA表达则呈下降趋势（P＜0.05）。结论 EB病毒microRNA Bart6-5p可能通过调控Dicer基因表达而进一步影响鼻咽癌的上皮间质转化过程。

鼻咽肿瘤；微小RNA；EB病毒；上皮间质转化

上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是解释肿瘤发生发展特别是侵袭与转移的重要理论模型，该理论主要观点认为肿瘤在发生发展过程中，肿瘤细胞由上皮样细胞演化到间质样细胞并发生肿瘤细胞侵袭与转移，其表型（细胞形态、侵袭能力等）及基因型（E-cadherin、Vimentin）均发生相应变化，目前该理论在上皮性来源肿瘤中基本都得到证实［1］。Dicer属于RNaseⅢ家族成员，是参与microRNA合成的重要蛋白质，而microRNA参与细胞周期和增殖，通过RNA干扰抑制Dicer基因而影响microRNA合成［2-3］。EB病毒是第一个被发现可编码microRNA的病毒，其microRNA表达谱对于病毒的潜伏及病毒相关肿瘤发生有重要作用。本研究初步探索Dicer是否与EB病毒microRNA互相影响，进而影响鼻咽癌EMT过程而直接影响肿瘤的发生发展。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

EB病毒阳性鼻咽癌细胞株C666-1和淋巴瘤细胞株Akata、Daudi、Raji及 Namalwa 均由中山大学肿瘤防治中心华南肿瘤学重点实验室赠送。胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、RPMI-1640、OPTI-MEM 无血清培养基购自Gibco公司，实时定量PCR反应试剂SYBR Green I Nucleic、Trizol Reagent及 Lipofectamine 2000 购自Invitrogen公司，反转录试剂盒及microRNA Bart6-5p抑制剂购自上海吉玛制药技术有限公司。

1.2 细胞培养及RNA提取

EB病毒阳性细胞株用含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。取对数生长期细胞，按照Invitrogen公司Trizol Reagent说明书提取RNA。每6孔板加入1 mL Trizol试剂，微量加样吸头反复吹打匀浆，室温静置5～10 min，直至细胞全部溶化；加入0.2 mL氯仿，振荡15 s，静置2～5 min。4℃1 351 r/min离心15 min，取上清液至新的EP管，加入0.5 mL异丙醇，轻轻混匀，4℃放置20～30 min。4 ℃ 1 351 r/min离心10 min，弃上清液。加入1 mL 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃1 068 r/min离心5 min，弃上清液。晾干，加入适量DEPC水溶解RNA。紫外分光光度计测定RNA浓度，-80℃冰箱保存。

1.3 实时荧光定量PCR检测

采用实时荧光定量PCR检测EB病毒阳性细胞株中microRNA Bart6-5p和Dicer mRNA的表达。反应体系：cDNA（1∶20）5.0 μL、上游和下游引物各 0.5 μL、2*SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、H2O 4 μL，总体积 20 μL。反应条件：95℃预变性10 min，95℃变性10 s，60 ℃退火 20 s，72 ℃延伸 10 s，共 40个循环，72℃延伸10 min。引物序列见表1。在目前发现的能够恒定携带EB病毒的鼻咽癌细胞株C666-1中抑制microRNA Bart6-5p后，再次检测Dicer及鼻咽癌EMT相关基因E-cadherin、Vimentin、ZEB1及ZEB2 mRNA的表达。实验结果采用2-△△ct法进行表达量相对定量分析。

表1 鼻咽癌EMT相关分子标志物的引物序列

1.4 microRNA Bart6-5p抑制剂转染鼻咽癌C666-1细胞

将EB病毒microRNA Bart6-5p抑制剂转染目前发现的能够恒定携带EB病毒的鼻咽癌细胞株C666-1。microRNA Bart6-5p抑制剂和EB病毒miRNA inhibitor NC按终浓度为100 nmol/L与等体积LP2000混合于OPTI-MEM低血清培养基中，按照LP2000说明书转染。转染后6 h更换10%FBS完全培养基，继续培养。同时以OPTI-MEM低血清培养基设置空白对照组，每组设3个复孔。转染12 h后流式细胞仪（Beckman Coulter Cytomics FC 500）计数10 000个细胞，计算阳性细胞百分率；荧光倒置显微镜（奥林巴斯研究级倒置显微镜IX71）观察细胞转染效果。

1.5 统计学处理

采用IBM SPSS Statistics 19.0统计软件进行数据分析，数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EB病毒阳性细胞株中microRNA Bart6-5p与Dicer mRNA的表达

实时荧光定量PCR检测结果显示，EB病毒阳性细胞 C666-1、Akata、Daudi、Raji及 Namalwa 中 microRNA Bart6-5p mRNA表达水平依次递减（P＜0.05），见图1A；Dicer mRNA表达水平则依次递增（P＜0.05），见图1B。

图1 EB病毒阳性细胞株中microRNA Bart6-5p与Dicer mRNA的表达

2.2 EB病毒microRNA Bart6-5p抑制剂的转染效率

流式细胞仪检测结果显示，加入EB病毒microRNA Bart6-5p抑制剂后转染率达77%左右（图2A），与显微镜下（放大100倍）观察的转染效率一致（图2B）。

2.3 microRNA Bart6-5p被抑制后Dicer和鼻咽癌EMT相关分子标志物mRNA的变化

明确microRNA Bart6-5p在5株EB病毒阳性细胞中的表达后，选取恒定携带EB病毒且microRNA Bart6-5p表达最高的鼻咽癌细胞C666-1，抑制其microRNA Bart6-5p表达后观察Dicer和鼻咽癌EMT相关分子标志物E-cadherin、Vimentin、ZEB1和ZEB2 mRNA的表达。结果发现，EB病毒的microRNA Bart6-5p被抑制后，Dicer基因mRNA表达呈升高趋势（F=1.637，P＜0.05），与鼻咽癌 EMT 呈正相关关系的分子标志物E-cadherin mRNA表达亦升高（F=2.764，P＜0.05），而与EMT呈负相关关系的分子标志物Vimentin、ZEB1和ZEB2 mRNA表达则呈下降趋势（F=1.527、2.847、1.219，P＜0.05）。见图 3。

图2 EB病毒microRNA Bart6-5p抑制剂的转染效率

图3 microRNA Bart6-5p被抑制后Dicer及鼻咽癌EMT相关分子标志物mRNA的变化

3 讨论

EB病毒是疱疹病毒家族成员，目前感染人类的疱疹病毒有8种，EB病毒是其中之一［4］。EB病毒目前被认为与多种疾病相关，其中包括非洲伯基特淋巴瘤［5-6］、霍奇金病［7-8］、胃腺癌［9］、乳腺癌［10-11］、鼻咽癌［12］及单核细胞增多症［3，8］等。microRNA 是内源性单链非编码RNA，长22～25nt，与靶基因3'UTR区种子结合位点配对结合，调节靶基因表达。越来越多证据表明microRNA表达及功能失调与肿瘤的发生密切相关［13］。

Dicer属于RNaseⅢ家族成员，是参与microRNA合成的重要蛋白质。研究表明，Dicer基因在大部分肿瘤组织中表达下调，可能在肿瘤发生发展及浸润转移过程中发挥重要作用［2］。研究发现77.6%的实体肿瘤组织样本中Dicer基因表达下调［14］。本研究就Dicer表达下调是否与EB病毒microRNA互相影响，进而影响肿瘤的发生发展进行初步探索。此外，Dicer基因也被证实与鼻咽癌的EMT调控密切相关，继而影响肿瘤的发生发展。目前该理论在上皮性来源肿瘤基本得到印证［1］。研究表明，EB病毒microRNA Bart6-5p可以靶向调控宿主细胞的Dicer［15］。本研究实时荧光定量PCR检测发现，在携带EB病毒的鼻咽癌细胞C666-1 及淋巴瘤细胞株 Akata、Daudi、Raji和 Namalwa中microRNA Bart6-5p mRNA表达水平越高，Dicer mRNA表达水平则相对越低，即EB病毒 microRNA Bart6-5p与Dicer表达呈负相关关系。这种靶向调节关系，经TargetScan分析发现Dicer基因3'UTR存在4个Bart6潜在调控靶点，亦表明Bart6可能靶向负调控宿主细胞的 Dicer［15］。

Dicer作为microRNA成熟的关键分子，其功能异常决定了microRNA丰度，且Dicer与多种肿瘤预后密切相关，可能通过调控肿瘤细胞的EMT而促进侵袭与转移。本研究进一步研究Dicer随microRNA Bart6-5p表达降低而升高后，鼻咽癌EMT相关分子标志物是否随之变化，结果发现，当恒定携带EB病毒的鼻咽癌细胞C666-1中的microRNA Bart6-5p被抑制后，Dicer mRNA的表达升高，正向调节EMT的分子标志物E-cadherin mRNA表达亦升高，而与EMT呈负相关关系的分子标志物Vimentin、ZEB1和ZEB2 mRNA表达则呈下降趋势，与Perdigão-Henriques等［16］报道一致。由此推测，当EB病毒microRNA Bart6-5p降低后，Dicer因失去microRNA Bart6-5p的靶向调节作用而反应性升高，继而发挥EMT调节作用，影响下游相关基因，最终影响肿瘤的发生发展。

本研究结果初步证明，在感染EB病毒情况下，EB病毒可能通过microRNA Bart6-5p靶向调节宿主细胞Dicer基因影响鼻咽癌的EMT，从而影响肿瘤的发生发展。但本研究仍处于初步阶段，EB病毒microRNA对鼻咽癌EMT过程存在的潜在调节作用及其具体机制，有待进一步探索。

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［2017-06-06收稿］［2017-07-08修回］［编辑 罗惠予］

Role of EBV microRNA Bart6-5p in the epithelial-mesenchymal transition in nasopharyngeal carcinoma

Yang Hongjie，Zhu Qingyao，Luo Jianchao，Han Qian
（Department of Radiation Oncology，Henan Provincial People's Hospital，Zhengzhou 450003，P.R.China）

ObjectiveTo investigate the ability of Epstein-Barr virus（EBV）microRNA Bart 6-5p to regulate Dicer expression and thereby influence the epithelial-mesenchymal transition（EMT）in nasopharyngeal carcinoma cells.MethodsExpression of microRNA Bart6-5p and Dicer were quantitated using real-time quantitative PCR in the EBV-positive nasopharyngeal carcinoma cell line C666-1 and lymphoma cell lines Akata，Daudi，Raji and Namalwa.In C666-1 cells with the highest EBV load，microRNA Bart6-5p expression was inhibited and subsequent changes in levels of EMT-related molecular markers were examined.ResultsBart6-5p expression followed the trend C666-1＞Akata＞Daudi＞Raji＞Namalwa，while Dicer followed the inverse trend.Inhibiting Bart6-5p expression in C666-1 increased expression of Dicer and the positive EMT marker E-cadherin，while it decreased expression of the negative EMT markers vimentin，ZEB1 and ZEB2.ConclusionEBV microRNA Bart6-5p can influence the EMT in nasopharyngeal carcinoma by regulating Dicer expression.

Nasopharyngeal neoplasm；microRNA；Epstein-Barr virus；Eepithelial mesenchymal transition

Zhu Qingyao.E-mail：zhuqingyao1983@sina.com

R739.63

A

1674-5671（2017）04-04

10.3969/j.issn.1674-5671.2017.04.11

朱庆尧。E-mail：zhuqingyao1983@sina.com