IL-17A与IRF-5遗传多态性与泉州地区类风湿关节炎相关性研究

罗彩林，郑晨娜，，饶华春，杨会勇

1.泉州医学高等专科学校基础医学部，福建泉州 362000；2.华侨大学分子药物研究所，福建泉州 362000；3.泉州市正骨医院临床检验科，福建泉州 362000

IL-17A与IRF-5遗传多态性与泉州地区类风湿关节炎相关性研究

罗彩林1，郑晨娜1，2，饶华春3，杨会勇2

1.泉州医学高等专科学校基础医学部，福建泉州 362000；2.华侨大学分子药物研究所，福建泉州 362000；3.泉州市正骨医院临床检验科，福建泉州 362000

目的 该文探讨白介素-17A（IL-17A）rs8193036C/T、rs2275913A/G与干扰素调节因子5（IRF-5）rs729302A/C基因多态性与福建泉州地区人群类风湿关节炎(RA)的易感性关联。 方法 采用病例-对照研究法，自2014年3月—2016年4月收集泉州正骨医院确诊RA患者108例 （病例组）和149名健康对照者 （对照组），应用三引物全血扩增法 （AS-PCR）对IL-17A rs8193036,rs2275913和IRF-5 rs729302进行基因分型，并用SPSS 18.0统计学软件进行数据结果分析。 结果RA组RF-阳性率、CRP-阳性率、ACCPA-阳性率分别为：88.89%、28.70%、72.22%，DAS28为（4.86±1.63）。IL-17A rs8193036C/T位点的3个基因型CC、TT、CT在健康对照组的分布频率分别为57.0%、16.8%、26.2%，在RA组的分布频率分别为61.1%、6.5%、32.4%，RA组的基因型频率与健康对照组相比，差异有统计学意义（P=0.042）,其中携带TT纯合子基因型的RA患病风险较高。IL-17A rs2275913 G/A位点的3个基因型AA、GA、GG在健康对照组的分布频率分别为23.5%、46.3%、30.2%，在RA组的分布频率分别为13.0%、52.8%、34.3%，RA组基因型频率与健康对照组相比，差异无统计学意义 （P=0.106）。IRF-5 rs729302A/C的AA、AC、CC基因型在健康对照组的分布频率分别为50.3%、39.6%、10.1%，在RA组的分布频率分别为47.7%、43.1%、8.3%,两组间比较差异无统计学意义 (P=0.781)。结论 IL-17A rs8193036C/T可能与泉州地区人群RA发病有弱相关性，其中IL-17A rs8193036中TT基因型携带者可能增加RA疾病的易感性。而IL-17A rs2275913A/G和IRF-5 rs729302A/C与泉州地区人群RA发病无相关性。

关节炎；类风湿；多态性；单核苷酸；白介素-17A；干扰素调节因子-5

遗传因素如单核苷多态性可能在类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)的发病机制中起到重要的作用。白介素-17（Interleukin-17，IL-17）是由Th17细胞分泌的一种致炎症因子，IL-17A/F基因多态性与许多自身免疫性疾病以及炎症反应有相关性。干扰素调节因子-5（Interferon Regulatory Factor 5，IRF-5）在细胞多种生理活动中发挥作用，也在RA发病过程中起着重要的作用[1-2]。根据两个基因在类风湿关节炎中的作用，该研究自2014年3月—2016年4月选取泉州市正骨医院已确诊的类风湿关节炎患者108例和在体检过程中健康志愿者149名作为研究对象，探讨了IL-17A rs8193036C/T、rs2275913A/G和IRF-5 rs729302A/C基因多态性与福建泉州地区人群类风湿关节炎(RA)的易感性关联，为进一步探讨泉州地区人群RA的发病特征与机制提供理论支持和数据分析。

1 对象与方法

1.1 对象

采用病例-对照法，所选的对象中类风湿关节炎患者达到ACR2010 RA分类标准，需要排除所选对象患有其他结缔组织疾病，感染性或者恶性肿瘤等疾病，平均年龄（56±12.29）岁；健康志愿者排除糖尿病、肿瘤、心血管疾病等基础性疾病，平均年龄在（55±11.69）岁。该研究由泉州市正骨医院伦理委员会批准，实验对象知情并同意研究的开展。

1.2 方法

1.2.1 外周血抽取 抽取待测人员的外周血，血液样本用EDTA、肝素和枸橼酸钠等抗凝剂做抗凝处理，抽取的血样于-20℃冰箱保存。

1.2.2 引物设计 从 ncbi网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)获取该SNP位点附近序列，利用Primer 5.0设计一条公共引物和一对3′端分别与SNP位点互补等位基因特异性引物，其中3′端第3个碱基引入一个人为错配碱基。IL-17A基因rs8193036C/T的一条通用引物序列FW 5’-CAGGAC AGGGAGGAATGGAT-3’，两条特异性引物分别是RN1 5’-TAGAGACTGGACAAAGGTGACGG-3’；RN2 5’-TAGAGACTGGACAAAGGTGACGA-3’。SNP位点rs2275913A/G通用引物RW 5’-TGGATGAGTTTGTGCCTGCT-3’两条特异性引物分别为FN1 5’-CTTCCCATTTTCCTTCAGACGA-3’；FN2 5’-CTTCCCATTTTCCTTCAGACGG-3’

IRF-5基因rs729302A/C通用引物Fw 5’-GGGCGGCATCGGGAGTGGAG-3’，两条特异性引物分别为RN1 5’-GACTCTGGTGTGTAGGTGATCGTGT-3’；RN25’-GACTCTGGTGTGTAGGTGATCGTGG-3’。所有引物合成均来自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2.3 全血三引物扩增法（AS-PCR）采用该课题组建立的三引物全血等位基因特异性PCR扩增法（AS-PCR）进行目的基因的SNP分型检测[3]。扩增体系如下：20 μL的体系加入0.3 μL 5 U/μL Taq DNA聚合酶（TaKaRa,大连），2 μL 2.5 mM dNTP，10 μmol/L通用引物和特异性引物各0.8 μL，2 μL 10×聚合酶链反应（PCR）缓冲液(含有Mg2+)，4 μL 50%甘油以及4 μL 5דYW”缓冲液 （该实验室研发），最后无菌H20补足19.6 μL,震荡混匀离心后加入外周血模板0.6 μL。反应体系参数设定：预变性温度96℃，时间4 min；变性温度95℃，时间30 s，复性温度58℃，时间30 s，延伸温度72℃，时间30 s，循环次数40；72℃延伸10 min，于4℃条件保存。扩增结束，吸取5 μL扩增产物，用2%的琼脂糖凝胶，100 V电压条件下电泳15 min。采用ExRed核酸染料进行染色，凝胶成像系统观察条带的位置和数目，并分析基因型。

1.3 统计方法

分析所选择样本目的基因各SNP基因型与类风湿关节炎发病风险，采用SPSS 18.0统计学软件统计分析；采用网络工具进行Hardy-Weinberg检验遗传平衡 (http://ihg.gsf.de/ihg/snps.html)，健康志愿者和类风湿关节炎患者组间比较采用χ2检验和logistic模型分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象特征分析及SNP位点Hardy-weinberg平衡检验

该文采用病例-对照研究法，其中RA患者年龄范围从10～89岁，健康对照者年龄范围从8～78岁，其中RA患者的临床表现见表1。为了检验该研究人群是否符合随机性抽样原则，将RA患者组和正常对照组3个SNPs位点的分布频率在 http://ihg.gsf.de/cgi-bin/hw/hwa1.pl网站进行 Hardy-weinberg平衡检验。结果表明除了 IL-17A rs8193036位点的健康对照组的群体基因遗传平衡 （P＜0.05）之外，IL-17A rs8193036 RA患者组以及 IL-17A rs2275913A/G和IRF-5 rs729302A/C健康对照组和RA患者组群体基因遗传平衡（P＞0.05），课件研究对象的选择符合随机性原则，研究对象具有群体代表性。

2.2 病例-对照组3个等位基因和基因型频率分布比较

IL-17A rs8193036 C/T、IL-17A rs2275913 G/A和IRF-5 rs729302A/C在正常对照组和RA组基因型及等位基因分布频率情况见表2。IL-17A rs8193036位点。

CC基因型在健康对照组的分布频率为57.0%，在RA组为 61.1%，TT基因型在健康对照组的分布频率为16.8%，在RA组为6.5%，CT基因型在健康对照组的分布频率为26.2%，在RA组为32.4%，RA组的基因型频率与健康对照组相比，差异有统计学意义（P=0.042）,与携带CC或CT基因型的研究对象相比，携带TT纯合子基因型的RA患病风险要高（TT vs.CC：OR,2.773；95%CI,1.130～6.805；P=0.022；TT vs.CC+CT:OR,2.909；95%CI,1.209～7.002；P=0.014）。健康对照组的等位基因C分布频率为70.1%，RA组为77.3%；健康对照组的等位基因T分布频率为29.9%，RA组为22.7%。等位基因C型和T型在RA-健康对照组患病风险比较，其OR值是1.451，95%CI为[0.969～2.173]，差异无统计学意义（P=0.070＞0.05）。

表1 RA患者临床特征

IL-17A rs2275913 G/A位点AA基因型在健康对照组的分布频率为23.5%，在RA组为13.0%，GA基因型在健康对照组的分布频率为46.3%，在RA组为52.8%，GG基因型在健康对照组的分布频率为30.2%，在RA组为34.3%，该位点RA组的基因型频率与健康对照组相比，差异无统计学意义（P=0.106）,与携带GG+GA基因型的患病风险相比较，携带AA基因型的患病风险要高 （AA vs. GA：OR,2.065；95%CI,1.013～4.210；P=0.044；AA vs.GG+ GA:OR,2.061；95%CI,1.049～4.058；P=0.034）。健康对照组的等位基因A分布频率为46.6%，RA组为39.4%；健康对照组的等位基因G分布频率为53.4%，RA组为60.6%。等位基因A型和G型在RA-健康对照组患病风险比较，其OR值是1.347，95%CI为[0.944～1.922]，差异无统计学意义（P=0.099 8＞0.05）。

IRF-5 rs729302A/C的AA基因型在健康对照组的分布频率为50.3%，在RA组为47.7%，AC基因型在健康对照组的分布频率为39.6%，在RA组为43.1%，CC基因型在健康对照组的分布频率为10.1%，在RA组为8.3%，该位点两组间比较差异无统计学意义(P=0.781)。健康对照组的等位基因A分布频率为70.1%，RA组为69.9%；健康对照组的等位基因C分布频率为29.9%，RA组为30.1%。等位基因A型和C型与RA-健康对照组患病风险比较，其OR值是1.011，95%CI为[0.690～1.481]，亦差异无统计学意义(P=0.956，P＞0.05)。说明该位点与泉州地区人群RA易感性无相关性。

表2 病例-对照组三个等位基因和基因型频率分布比较

3 讨论

类风湿关节炎是一种慢性、自身免疫性疾病，属于系统性炎症。在RA发病发展的炎症性细胞网络中，Th17细胞在促进自身免疫性进程、骨损伤以及血管生成均起了重要作用。根据文献资料选取 IL-17A rs2275913 G/A, rs8193036 C/T与泉州地区RA患者的相关性进行研究。Nordang等[4]检测了IL-17A基因多态性与来自于挪威和新西兰的高加索RA易感性的相关性研究，发现IL-17A rs2275913在挪威RA人群呈弱相关性，然而与新西兰RA人群无关联性。来自日本的研究报道IL-17A基因SNP rs3804513与2年内RA影像进程有弱相关性 （P=0.049），这说明IL-17在日本人群RA发病初期与骨关节损伤有一定的关联[5]。Bogunia-Kubik等[6]和Pawlik等[7]两个不同的研究团队先后在波兰RA人群研究中发现IL-17A基因rs2275913与 RA易感性无关联性，而对 IL-17F基因rs763780与RA人群关联性得出了完全相反的结论。选取了108例RA患者和149名健康对照者作为研究对象，其中发现rs8193036C/T位点等位基因频率患者-健康对照者比较差异有统计学意义（P=0.042），与RA易感性有弱关联性，其中携带TT纯合子基因型的RA患病风险要高（TT vs.CC：OR,2.773；95%CI,1.130～6.805；P=0.022；TT vs.CC+CT:OR,2.909；95%CI,1.209～7.002；P=0.014）。Shen等人[8]研究发现IL-17A rs2275913和rs3819024两个位点的等位基因可能会降低RA风险性。而该研究则发现携带IL-17A rs2275913 AA基因型的人群RA患病风险增高（AA vs.GA：OR,2.065；95%CI,1.013-4.210；P=0.044；AA vs.GG+GA:OR,2.061；95%CI,1.047-4.058；P=0.034），而该位点的基因型和等位基因频率与健康对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）,这可能是该次选取的样本数较少缘故或是存在地域性的差异所致。

IRF-5基因位于染色体7q32上，IRF-5的启动区和5’UTR区的遗传多态性与RA的易感有强相关性，因此该区域可用来分析IRF-5的转录机制以及与RA的发病机理之间的关系[9]。IRF-5同时还是一种转录因子，当机体受到病毒感染时，IRF-5激活并转录出IRF-5蛋白，再调控产生干扰素和其他致炎因子[10]，由此可见IRF-5在致炎细胞因子和趋化因子的转录调节中起重要作用。IRF-5的SNP位点在不同人群RA患者的相关性也不尽相同，如rs2004640，rs752637，rs3807306和rs3757385，在无CCP抗体人群中，保护性基因型分别为AGAC。而IRF-5rs2004640，rs729302和rs752637多态性与RA易感性在不同的族群相关性不同，该结果已在欧洲人和亚洲人群中得到证实，而其他族群这种关联性需要进一步研究。从以上研究结果可以看出，IRF-5多态性与RA相关性依据人种群不同而不同，甚至在同一种群结构也有差异。该次选取了IRF-5基因rs729302位点作为研究对象，与福建泉州RA人群的相关性。实验结果表明rs729302A/C在健康和RA患者比较，基因型和等位基因均差异无统计学意义（P＞0.05）。说明该位点与福建泉州人群的RA易感性无相关性。

综上所述，通过统计学分析得到IL-17A rs8193036C/ T,IL-17A rs2275913G/A和IRF-5 rs729302A/C基因多态性对福建泉州地区RA人群的易感性有一定的关联，其中携带IL-17A rs8193036的TT基因和rs2275913的AA基因的人群可能属于风险性较高的人群，而IRF-5 rs729302与该地区的RA人群无关联性。

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Research on Correlation between the IL-17A and IRF-5 Genetic Polymorphism and Rheumatoid Arthritis in Quanzhou Region

LUO Cai-lin1,ZHENG Chen-na1,2,RAO Hua-chun3,YANG Hui-yong2
1.Basic Medicine Department,Quanzhou Medical College,Quanzhou,Fujian Province,362000 China；2.Institute of Molecular Medicine,Huaqiao University,Quanzhou,Fujian Province,362000 China；3.Department of Clinical Laboratory,Quanzhou Orthopedic-traumatological Hospital,Quanzhou,Fujian Province,362000 China

Arthritis;Rheumatoid;Polymorphism;Mononucleotide;Interleukin-17A;Interferon regulatory factor-5

R446

A doi 10.11966/j.issn.2095-994X.2017.03.03.04

2017-06-07；

2017-06-27

福建省自然科学基金资助项目（2015J01138）;福建省自然科学基金资助项目（2016J01420）。

罗彩林（1981-），女，福建三明人，硕士，讲师，研究方向：生物化学与分子生物学。

郑晨娜（1978-），女，河北沧州人，硕士，副教授，研究方向：医学诊断学、生物化学与分子生物学，E-mail:chennzh2009@126. com。

AbstractObjective To study the correlation between the interleukin-17A（IL-17A）rs8193036C/T,rs2275913A/G,（IRF-5）rs729302A/ C genetic polymorphism and susceptibility of rheumatoid arthritis in Quanzhou region.Methods 108 cases of RA patients and 149 cases of healthy people in our hospital from March 2014 to April 2016 were selected and respectively used as the case group and control group,and AS-PCR was used for genotyping of IL-17A rs8193036,rs2275913 and IRF-5 rs729302,and the data results were analyzed by the statistical software SPSS 18.0.Results The positive rates of RF,CRP and ACCPA in the RA group were respectively 88.89%,28.70%,72.22%and DAS28 was 4.86±1.63,and the distribution frequencies of three gene types of CC,TT,CT in the IL-17A rs8193036C/T sites in the healthy control group were respectively 57.0%,16.8%,26.2%,and the distribution frequencies in teh RA group were respectivly 61.1%,6.5%,32.4%,and the difference in the gene frequency between the RA group and healthy control group was statistically significnat（P=0.042）,and the prevalence risk of RA with TT homozygote genotype was higher and teh distribution frequencies of the three genetypes AA,GA,GG in the IL-17A rs2275913 G/A sites in the healthy control group were respectively 23.5%,46.3%,30.2%,and the distribution frequencies in the RA group were respectively 13.0%,52.8%,34.3%,and the differences between the two groups were not statistically significant（P=0.106）,and the distribution frequencies of AA,AC,CC of IRF-5 rs729302A/C in the healthy control group were respectively 50.3%,39.6%,10.1%and in the RA group were respectively 47.7%,43.1%,8.3%,and the differences between the two groups were not statistically significant(P=0.781).Conclusion IL-17A rs8193036C/T may have a weak correlation with the RA incidence in population in Quanzhou region,and TT genotype carriers of IL-17A rs8193036 may increase the susceptibility of RA disease,and IL-17A rs2275913A/G and IRF-5 rs729302A/C have no correlation with the RA incidence in population in Quanzhou region.