超声辅助提取—HPLC—ICP—MS同时测定水产及其制品中3种形态汞的含量

乔 晴

何兵兵

王向军

李 辰

刘军红

(河南出入境检验检疫局，河南 郑州 450003)

超声辅助提取—HPLC—ICP—MS同时测定水产及其制品中3种形态汞的含量

乔 晴

何兵兵

王向军

李 辰

刘军红

(河南出入境检验检疫局，河南 郑州 450003)

建立了采用超声辅助提取，高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用技术测定水产及其制品中汞形态分析的方法。在盐酸+L-半胱氨酸体系下，对样品进行超声辅助萃取，以10 mmol/L乙酸铵+0.10%L-半胱氨酸缓冲盐与甲醇(体积比98∶2)组成流动相，用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱仪同时检测无机汞、甲基汞和乙基汞的含量。无机汞、甲基汞和乙基汞的检出限(3S/N)分别为0.18，0.09，0.15 ng/mL，标准曲线回归方程相关系数(R)均>0.999。以实际样品对无机汞、甲基汞、乙基汞进行加标回收试验，回收率在78.5%～96.8%，相对标准偏差(RSD)≤3.0%。经对标准物质进行检测，测得值与标准值吻合。该方法准确可靠、简单快速、精密度及准确度结果理想，可用于实际水产及其制品中汞形态的分析。

无机汞；甲基汞；乙基汞；水产品；超声辅助提取；高效液相色谱；电感耦合等离子体质谱

汞俗称水银，是对人类和高等生物具有危害的有毒元素之一，挥发性强，熔点低，毒性较大。汞是在生态系统中能完善循环的唯一重金属，汞及其化合物容易被生物体吸收，通过食物链(尤其是水生生物的食物链)富集并传递，最终导致水生动物体内汞浓度大大超出环境水体中的汞浓度。水产类膳食是人类摄入汞的主要途径。不同形态的汞及其化合物都会威胁人类健康，造成人体免疫、神经以及心血管等多系统损害，并且还有致癌作用。中国GB 2762—2012《食品中污染物限量》规定鱼类中甲基汞限量为0.5 mg/kg，食肉鱼类为1.0 mg/kg；日本规定水产品中甲基汞限量为0.3 mg/kg(不适用河川淡水鱼)[1]；美国规定鱼类甲基汞限量为1.0 mg/kg(湿重)[2]。

目前汞的形态分析主要有GC—MS联用法、HPLC—AFS联用法、HPLC—UV联用法、HPLC—ICP—MS联用法等[3-5]。GC—MS联用法检测速度快灵敏度高，然而杂质干扰多，前处理复杂；HPLC—UV联用法选择性差，基体干扰严重，灵敏度低，操作复杂，目前已很少使用；HPLC—AFS联用法测定的灵敏度虽然能满足检测需求，但需要加入强氧化剂将有机汞氧化成无机汞，可能会出现反应不充分，转化率低的缺陷，实际应用性差。而HPLC—ICP—MS联用法可以获得更低的检出限和更好的灵敏度，选择性强，已成为形态分析技术中的首选。

本试验依据GB 5009.17—2014《食品安全国家标准 食品中总汞及有机汞的测定》中第二篇食品中甲基汞的测定方法(液相色谱—原子荧光光谱联用方法)，通过对超声提取工艺的优化，以及采用液相色谱与电感耦合等离子体质谱联用法，并对测定条件进行优化，旨在建立一套适用于同时分析水产及其制品中3种汞形态含量的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器

电感耦合等离子体质谱仪：ICP-MS 7900型，美国安捷伦公司；

高效液相色谱：HPLC 1200型，美国安捷伦公司；

雾化器：ICP-MS PFA型，美国安捷伦公司；

Zorbax Eclipse Plus C18：150 mm×4.6 mm，5 μm，美国安捷伦公司；

电子天平：XP205型，瑞士梅特勒-托利多公司；

高速冷冻离心机：Z300K型，德国哈默公司；

超声波清洗机：KANG SHIJIE PL-J60型，0.45 μm滤膜，天津市津腾实验设备有限公司；

超纯水系统：Millipore型，法国密理博公司。

1.2 试剂与标准品

试验用水：符合GB/T 6682—2008规定的一级水，超纯水系统制备；

乙酸铵：分析纯，北京化工厂；

甲醇：色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司；

氢氧化钠：优级纯，国药化学试剂有限公司；

L-半胱氨酸盐酸盐：生化试剂，天津市致远化学试剂有限公司；

甲基汞标准溶液：GBW 08675，(63.6±2.4) μg/g，国家标准物质研究中心；

乙基汞标准溶液：GBW(E) 081524，(76.4±2.8) μg/g，国家标准物质研究中心；

无机汞标准溶液：GBW 08617，1 000 μg/mL，国家标准物质研究中心。

1.3 溶液的配制

1.3.1 盐酸溶液(5 mol/L) 准确量取41.66 mL盐酸，用水稀释定容至100 mL。

1.3.2 氢氧化钠溶液(6 mol/L) 准确量取24 g氢氧化钠，溶于水并定容至100 mL。

1.3.3 氨水溶液(20 mL/100 mL) 准确量取10 mL氨水，缓慢倒入50 mL水中，混匀。

1.3.4 提取溶液(5 mol/L盐酸+0.10%L-半胱氨酸) 称取0.1 gL-半胱氨酸,用水溶解，缓慢加入41.66 mL盐酸，用水稀释定容至100 mL。

1.3.5 流动相 流动相A(10 mmol/L 乙酸铵，0.10%L-半胱氨酸，pH=7.5)：称取0.771 g乙酸铵和1 gL-半胱氨酸，用水溶解，加水稀释定容至1 000 mL。用20 mL/100 mL氨水溶液调节pH至7.5，经0.45 μm滤膜过滤，超声脱气30 min；流动相B为甲醇。

1.3.6 甲基汞标准储备液(2 μg/mL) 准确称取0.786 2 g甲基汞标准溶液，用2%甲醇稀释定容至25 mL。

1.3.7 乙基汞标准储备液(2 μg/mL) 准确称取0.654 5 g乙基汞标准溶液，用2%甲醇稀释定容至25 mL。

1.3.8 无机汞标准储备液(2 μg/mL) 准确称取10 mL无机汞标准溶液，用5%盐酸稀释定容至100 mL，再分取2 mL用2 % 甲醇稀释定容至100 mL。

1.3.9 混合标准使用液(50 ng/mL) 准确移取甲基汞标准储备液、乙基汞标准储备液和无机汞标准储备液各0.625 mL，用2%甲醇稀释定容至25 mL。使用时现配。

1.3.10 混合标准工作液 分别移取混合标准使用液0.0，0.1，0.2，0.4，1.0，2.0 mL于一组10 mL容量瓶中，用流动相定容至刻度，得到甲基汞、乙基汞和无机汞的浓度分别0.0，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 ng/mL的混合标准工作液。

1.4 试验方法

1.4.1 样品处理 取可食部分，用捣碎机打成匀浆，均分成2份作为试样，分别装入洁净的容器内，密封并标记。于-18 ℃以下保存。

称取样品1 g(精确到0.001 g)，置于25 mL离心管中，加入10 mL提取溶液，放置过夜。在20 ℃、40 kHz、300 W下超声萃取(超声提取时温度会升高，容易使无机汞挥发，所以选择20 ℃下提取)1.5 h，期间振摇数次。于4 ℃下以4 500 r/min 离心30 min。移取4 mL上清液至25 mL刻度管中，逐滴缓慢加入氢氧化钠溶液(6 mol/L)，调节pH至2～7，用水定容至10 mL，再用0.45 μm滤膜过滤，待测。同时作空白试验。

1.4.2 仪器条件 色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱；流动相：流动相A(10 mmol/L 乙酸铵—0.10%L-半胱氨酸，pH 7.5)与流动相B(甲醇)98∶2(体积比)；流速：1.0 mL/min；进样量：50 μL。仪器参考工作条件及参数见表1。

表1 ICP—MS工作条件

1.4.3 样品测定 依次对混合标准溶液系列、空白溶液和试样溶液进行测定，以其标准溶液峰的保留时间定性，用标准工作曲线对试样进行定量。按上述步骤，对同一试样进行平行试验。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理的选择

有机汞化合物在生物样品中容易与S牢固结合，利用有机溶剂破坏硫化物并转变为卤代烷基汞，是提取、分离有机汞最有效的方法之一[6-8]。常用的汞化合物的提取方法主要有碱消解提取、酸消解提取、固相微萃取、水蒸气蒸馏和固相萃取等[9]。试验中比较了碱消解和酸消解的提取效果，发现碱消解提取所需时间较长，并且在甲基汞含量较低时存在复杂的基体效应。因此，试验中选用盐酸+L-半胱氨酸作为水产及其制品样品汞形态分析的提取剂。

2.1.1 盐酸浓度 选取标准物质SRM 2976贻贝[甲基汞(28.09±0.31) μg/kg]进行测定，比较了不同浓度盐酸的提取效果，结果见表2。

表2 盐酸浓度对提取效率的影响

由表2可知，盐酸浓度越大提取效率越高，当加入盐酸浓度>5 mol/L时，提取率基本比较稳定，但随着盐酸浓度增加，中和盐酸需要的碱溶液过多，使样品溶液中离子浓度过高，对ICP—MS检测器有影响。因此，盐酸提取的浓度选择5 mol/L。

2.1.2L-半胱氨酸的浓度L-半胱氨酸中的S与Hg结合，可以形成金属-半胱氨酸络合物，在一定的酸度下，可将样品中不同形态的汞提取出来。试验比较了在提取液中盐酸浓度不变的情况下，分别加入不同量的L-半胱氨酸，使其含量分别为0.02%，0.05%，0.10%，0.15%，0.20%，通过对标准物质SRM 2976贻贝[甲基汞(28.09±0.31) μg/kg]中提取的甲基汞含量进行上机测定，结果见表3。

由表3可知，0.10%的L-半胱氨酸对水产品及其制品样品中甲基汞的提取效果最好。

表3 L-半胱氨酸浓度对提取效率的影响

2.1.3 超声提取时间 选取标准物质SRM 2976贻贝[甲基汞(28.09±0.31) μg/kg]，加入25 μg/kg的无机汞、甲基汞和乙基汞混合标准溶液，在20 ℃下分别超声提取0.5，1.0，1.5，2.0，3.0 h，期间振摇数次，测定无机汞、甲基汞和乙基汞的加标回收率，结果见表4。

表4 不同超声提取时间的加标回收率

由表4可知，超声提取1.5 h时，3种形态汞的加标回收率已能够满足检测要求。综合考虑工作效率等因素，最终选择超声提取时间为1.5 h。

2.2 流动相的选择

2.2.1 乙酸铵浓度的影响 在流动相中加入乙酸铵，可以稳定流动相的酸度，改善峰型和拖尾现象[10]。试验分别比较了不同浓度的乙酸铵对不同形态汞的分离效果。结果表明，随着乙酸铵浓度的增加，仪器响应值增加，各种形态汞的峰型有所改善，出峰时间缩短，拖尾逐渐有所改善。但当乙酸铵浓度达到10 mmol/L以上时，各种汞形态的色谱峰拖尾不再有明显改善，尤其是无机汞和甲基汞分离效果变差(见图1)。故选择乙酸铵的浓度为10 mmol/L。

2.2.2 络合剂的影响 在用反相液相色谱分析无机汞、甲基汞和乙基汞时，加入适当的络合剂，使其和样品中的各形态汞反应，形成非极性络合物，从而实现在C18柱上保留分离[11-13]。L-半胱氨酸无毒无害，亲水性较强，络合能力较弱，检测时间短。通过比较不同浓度的L-半胱氨酸对汞形态的分离效果和峰形影响，结果表明，L-半胱氨酸的浓度对汞化合物的分离和保留有很大影响。当不加入L-半胱氨酸时，不同形态的汞无法分离，谱图上出现单峰，或者出峰时间过长；随着L-半胱氨酸的加入，3种形态汞的分离度明显改善，拖尾现象减弱，灵敏度大大提高，见图2。当L-半胱氨酸浓度达到0.10%及其以上时，这3种形态汞的峰形、保留时间和灵敏度不再有明显变化，且对色谱柱的损害较大。综合考虑，选择0.10%L-半胱氨酸作为流动相中的络合剂，需临配现用。

图1 不同浓度乙酸铵的色谱图

图2 不同浓度L-半胱氨酸的色谱图

2.2.3 pH的影响 试验考察了流动相的pH值(pH 4.0～8.0)对3种形态汞的分离度、保留时间、响应值等的影响。结果表明：在试验范围内，当pH较小时，色谱峰形较差；当pH>6.0时，色谱峰形开始有所改善，但随着pH的增大，3种形态汞的分离度、保留时间变化不大。当pH为7.5时，色谱峰形相对更对称尖锐，见图3。因此，最终选择流动相的pH为7.5。

2.2.4 甲醇浓度的影响 试验考察了流动相中不同浓度的甲醇(2，5，8 mL/100 mL)对不同形态汞的保留时间和分离效果的影响，结果见图4。

由图4可知，随着甲醇浓度的增加，会导致汞化合物分离效果逐渐变差，可能是ICP—MS的采样锥和截取锥的锥口积碳，造成 ICP—MS的信号不稳定。因此试验最终选用 2 mL/100 mL 的甲醇作为流动相，能达到理想的分离效果。

图3 不同pH值的色谱图

图4 不同浓度甲醇的色谱图

2.3 分离效果

采用1.4试验条件测定5 ng/mL汞混合标准溶液，无机汞、甲基汞、乙基汞的保留时间分别为1.751，2.501，5.201 min，色谱分离效果好，见图5。

2.4 标准曲线和检出限

待仪器状态稳定后，使用调谐液对仪器双电荷、灵敏度、氧化物、分辨率等指标进行调谐，达到最优。以色谱峰面积为纵坐标，标准溶液中3种形态汞的浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程、相关系数及检出限(3S/N)，结果见表5。

图5 汞形态的色谱分离图

汞化合物线性范围/(ng·mL-1)线性方程相关系数检出限/(ng·mL-1)无机汞0.5^10.0Y=56972X+4650.99990.18甲基汞0.5^10.0Y=55865X+1160.99990.09乙基汞0.5^10.0Y=52340X+1821.00000.15

2.5 回收率和精密度

选取三文鱼肉样品，根据GB 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》中方法确认要求，进行3个不同浓度水平的加标回收率和精密度试验，结果见表6。

2.6 标准物质的验证

对标准物质SRM 2976贻贝[甲基汞(28.09±0.31) μg/kg]进行测定，实际测定值27.82 μg/kg，RSD为1.66%，3种汞形态的色谱图见图6。

2.7 实际应用

选取市售部分水产品及其制品，分别测定样品中的无机汞、甲基汞及乙基汞的含量，同时在样品中添加1 ng/mL浓度水平的无机汞、甲基汞及乙基汞混合标准溶液，进行加标回收测定，结果见表7。

表6 加标回收率和精密度结果†

† N.D.表示未检出。

图6 标准物质的色谱图

由表7可知，所测水产及其制品中的汞主要以甲基汞的形态存在，乙基汞均未检出，未经加工过的冰鲜水产品中的甲基汞较高。依据中国GB 2762—2012的规定，鱼类中甲基汞含量≤0.5 mg/kg，食肉鱼类为≤ 1.0 mg/kg，本试验所测的水产品及其制品中甲基汞含量均未超标。

3 结论

本试验建立了5 mol/L盐酸+0.10%L-半胱氨酸超声辅助萃取前处理，HPLC—ICP—MS联用技术测定水产品中甲基汞、乙基汞和无机汞的方法。该方法简单快速，提取效率高，精密度及准确度结果理想，克服了GB 5009.17—2014

表7 样品分析结果†

† N.D.表示未检出。

测定甲基汞方法实际应用性差的缺点，可广泛应用于水产及其制品中汞形态的分析。但是由于甲基汞和无机汞化学性质相似，如何使甲基汞和无机汞达到更加理想的分离效果，同时获得更好的灵敏度，是汞形态分析技术下一步面对的最大问题。

[1] 欧阳珮珮, 黄诚, 丘福保. 高效液相色谱—电感耦合等离子体质谱法同时测定水产品中的无机汞、甲基汞和乙基汞[J]. 中国卫生检验杂志, 2016, 26(1): 50-53.

[2] 刘奇, 柯常亮, 陈洁文, 等. 水产品中甲基汞测定方法的优化[J]. 食品工业科技, 2016(3): 299-302.

[3] 傅雄伟, 李海普, 杨远, 等. 高效液相色谱与电感耦合等离子体质谱联用测定水中的二价汞、甲基汞与乙基汞[J]. 理化检验: 化学分册, 2016, 52(11): 1 277-1 281.

[4] 王征, 游飞明, 邱秀玉, 等. HPLC-ICP-MS 法测定水样中的甲基汞、乙基汞和无机汞[J]. 福建分析测试, 2009, 18(1): 28-31.

[5] 黄先亮, 屠大伟, 朱永红, 等. 食品安全元素形态分析联用技术的应用[J]. 中国调味品, 2014, 39(5): 134-140.

[6] 林少英, 程允杰, 区文凯, 等. 超声萃取—冷蒸气—原子荧光光谱法测定常见水产品中甲基汞[J]. 疾病监测与控制, 2016, 10(11): 872-873.

[7] 童银栋, 郭明, 张巍, 等. 甲苯二次萃取—直接测汞法快速测定海产品中的甲基汞[J]. 环境化学, 2011, 30(4): 766-770.

[8] 孙瑾, 陈春英, 李玉锋, 等. 超声波辅助溶剂萃取—电感耦合等离子体质谱法测定生物样品中的总汞和甲基汞[J]. 光谱学与光谱分析, 2007, 27(1): 173-176.

[9] 吕蕾. 水产品中总汞和甲基汞、乙基汞的测定方法的建立[D]. 青岛: 青岛大学, 2009: 8-12.

[10] 梅光明, 郭远明, 朱敬萍, 等. 高效液相色谱—原子荧光光谱法测定水产品中汞的形态[J]. 理化检验: 化学册, 2013, 49(7): 840-843.

[11] SARZANINI C, SACCHERO G, ACETO M, et al. Simultaneous determination of methyl-, ethyl-, phenyl-and inorganic mercury by cold vapour atomic absorption spectrometry with on-line chromatographic separation[J]. Journal of Chromatography A, 1992, 626(1): 151-157.

[12] FALTER R, SCHOLER H F. Interfacing high-performance liquid chromatography and cold-vapour atomic absorption spectrometry with on-line UV irradiation for the determination of organic mercury compounds[J]. Journal of Chromatography A, 1994, 675(1/2): 253-256.

[13] 梁立娜, 江桂斌. 高效液相色谱及其联用技术在汞形态分析中的应用[J]. 分析科学学报, 2002, 18(4): 338-343.

Simultaneous determination of the content of the different mercury speciation in aquatic products by liquid chromatography-inductively coupled plasma mass spectrometry coupled with ultrasonic-assisted extraction

QIAOQing

HEBing-bing

WANGXiang-jun

LIChen

LIUJun-hong

(HenanEntry-ExitInspection&QuarantineBureauofP.C.R,Zhengzhou,Henan450003,China)

Ultrasonic assisted extraction coupled with high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma mass spectrometry was developed for the determination of mercury speciation in aquatic products. Using ultrasonic assisted extraction for sample in HCl +L- cysteine system, with 10 mmol/L ammonium acetate +0.10%L- cysteine buffer and methanol (98∶2) system consisting of mobile phase, and detected the content of inorganic mercury and methyl mercury and ethyl mercury by high performance liquid chromatography- inductively coupled plasma mass spectrometry. The detection limits (3S/N) of inorganic mercury, methyl mercury and ethyl mercury were 0.18, 0.09, 0.15 ng/mL, respectively. The correlation coefficient (R) of the regression equation of the standard curve was above 0.999. Inorganic mercury and methyl mercury, ethyl mercury were spiked in actual samples, the rate of recovery was 78.5%～96.8%, the relative standard deviation (RSD)≤3.0%. The standard substance was detected by this method, and the measured value was consistent with the standard value. The method is accurate, reliable, simple, rapid and accurate. It can be applied to the analysis of mercury speciation in aquatic products.

Inorganic mercury; methyl mercury; ethyl mercury; aquatic product; ultrasonic-assisted extraction; HPLC; ICP-MS

河南省科技厅科技攻关项目(编号：162102310065)

乔晴(1983—)，女，河南出入境检验检疫局工程师，硕士。E-mail:89478260@qq.com

2017—05—11

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.07.014