细胞源γ干扰素的表达与宫颈癌患者预后的关系研究

王新月，马 冬，张 琪，常凌雅，张丽杰，闫锡钊，王 洋，陈丽荣，陈允恩，李 鸥

王新月1，马 冬1，张 琪1，常凌雅1，张丽杰1，闫锡钊1，王 洋1，陈丽荣2，陈允恩1，李 鸥3*

宫颈肿瘤；CD56；干扰素γ；预后

本研究背景：

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2008年2月—2011年11月在唐山市工人医院活检或妇产科手术切除的宫颈炎、宫颈癌前病变及宫颈癌标本共计121例，其中慢性宫颈炎患者25例(对照组)、宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅰ级患者11例(CINⅠ组)、CINⅡ/Ⅲ级患者45例(CINⅡ/Ⅲ组)，宫颈鳞癌(SCC)患者40例(SCC组)。40例SCC患者中Ⅰ期17例，ⅡA期11例，ⅡB期12例。所有受试者术前未行化疗、放疗或生物治疗。研究样本的收集获得患者知情同意。

1.2 随访 SCC组患者自病理确诊之日起开始随访，治疗后2年内每3个月门诊复查1次，3～5年内每6个月门诊复查1次，随访截至2015年12月，共计随访5年，平均随访时间33个月。若未就诊于本院门诊复查者，进行电话随访，主要记录症状、复查情况、复发情况、生存时间(月)及随访时状态(存活、死亡或其他)等，患者因死亡或其他原因失联，则停止对其随访。

1.3 主要仪器与试剂 ABI 7500荧光定量聚合酶链式反应(PCR)仪(美国ABI公司)，自动脱水机、石蜡切片机、石蜡包埋机、烤片机(上海艾测电子科技有限公司)，正置显微镜(德国FLUKO公司)；单克隆抗人IFN-γ抗体(1∶50 dilution;R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)，cDNA反转录试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，CA，美国)，12+2高危型HPV联合16/18基因分型检测试剂盒(广东凯普生物科技股份有限公司)。

1.5 HPV检测 避开月经期，24 h不上药、不冲洗、无性生活。充分暴露宫颈外口，棉签轻拭表面分泌物，将细胞刷尖端插入宫颈口，轻轻加压并顺时针旋转5圈[7]，细胞刷去除刷柄后放入专用的细胞保存液中，送病理科。HPV亚型检出项包括：HPV16、18型和其他12种高危型(即HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)。

1.6 实时荧光反转录PCR(qRT-PCR)法测定不同病理宫颈组织中IFN-γ mRNA的表达 Trizol试剂提取不同病理宫颈组织中的总RNA(Invitrogen公司)，根据其在波长260/280 nm处的吸光度值，对核酸进行定量，采用cDNA反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。最后进行实时定量PCR分析。所需引物序列设计来自Primer 5.0，引物合成由宝生物工程(大连)有限公司合成。IFN-γ：上游引物：5′-TATAGGTGGGTATAATGGGTTT-3′，下游引物：5′-ATCAAAACAATATACTACACCTCCT-3′；GAPDH：上游引物：5′-GGAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游引物：5′-CGTTCTCAGCCTTGACGGT-3′。使用SYBR绿色®PCR Master Mix(应用生物系统)7500实时PCR系统评价IFN-γ mRNA表达。GAPDH作为内参基因，以公式2-ΔΔCt(Ct为循环阈值)计算IFN-γ mRNA表达水平。

2 结果

注：CIN=宫颈上皮内瘤变，SCC=宫颈鳞癌

2.2 HPV阳性与IFN-γ mRNA表达水平关系 4组HPV16阳性率比较，差异有统计学意义(P<0.05)；4组HPV18、其他12种高危型阳性率比较，差异均无统计学意义(P>0.05，见表2)。对照组HPV16阳性者IFN-γ mRNA表达低于HPV16阴性者，差异有统计学意义(P<0.05，见表3)；CINⅠ组HPV16阳性与阴性者IFN-γ mRNA表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表4)；CINⅡ/Ⅲ和SCC组HPV16阳性者IFN-γ mRNA表达高于HPV16阴性者，差异均有统计学意义(P<0.05，见表5、6，图2)。

组别例数CD+56细胞百分比CD+56IFN⁃γ+细胞百分比对照组251 87±0 121 97±0 07CINⅠ组112 21±0 20a1 82±0 06CINⅡ/Ⅲ组453 15±0 14ab1 43±0 12abSCC组402 99±0 11abc0 86±0 18abcF值95 2379 92P值<0 001<0 001

注：CIN=宫颈上皮内瘤变，SCC=宫颈鳞癌；与对照组比较，aP<0.05；与CINⅠ组比较，bP<0.05；与CINⅡ/Ⅲ组比较，cP<0.05

表2 4组HPV阳性率比较〔n(%)〕

注：HPV=人乳头瘤病毒

Table3 Comparison of expression levels of IFN-γ mRNA in patients with and without HPV16 infection in the control group

HPV16例数IFN⁃γmRNA阳性21 96±0 13阴性232 34±0 21t值2 491P值0 020

注：IFN-γ=γ干扰素

Table4 Comparison of expression levels of IFN-γ mRNA in patients with and without HPV16 infection in the CINⅠ group

HPV16例数IFN⁃γmRNA阳性51 84±0 43阴性61 79±0 29t值0 230P值0 823

Table5 Comparison of expression levels of IFN-γ mRNA in patients with and without HPV16 infection in the CINⅡ/Ⅲ group

HPV16例数IFN⁃γmRNA阳性291 66±0 11阴性161 21±0 16t值11 150P值<0 001

Table6 Comparison of expression levels of IFN-γ mRNA in patients with and without HPV16 infection in the SCC group

HPV16例数IFN⁃γmRNA阳性290 89±0 12阴性110 56±0 09t值8 256P值<0 001

图2 不同病理宫颈组织中IFN-γ mRNA表达

Figure2 Expression levels of IFN-γ mRNA in different cervical pathological tissues

基本特征例数高表达低表达χ2值P值年龄(岁)0 4520 501 ≤50278(29 6)19(70 4) >50136/137/13初次性生活年龄(岁)-0 350 ≤1611/10 >163913(33 3)26(66 7)流产次数(次)-1 000 ≤23813(34 2)25(65 8) >221/21/2HPV16阳性1 5010 221 是298(27 6)21(72 4) 否116/115/11贫血0 0020 965 是73/74/7 否3311(33 3)22(66 7)组织学分级3 1990 074 高分化75/72/7 中低分化339(27 3)24(72 7)肿瘤大小(cm)0 0630 802 ≤43513(37 1)22(62 9) >451/54/5宫旁浸润3 8150 051 是121/1211/12 否2813(46 4)15(53 6)淋巴结转移4 4260 035 有909/9 无3114(45 2)17(54 8)FIGO分期(期)7 3760 007 Ⅰ1710/177/17 Ⅱ234(17 4)19(82 6)

注：-采用Fisher确切概率法

图3 SCC组患者宫颈组织中表达与预后生存率的关系

3 讨论

作者贡献：王新月进行文章的构思与设计、统计学处理、结果的分析与解释及撰写论文；张琪、常凌雅、张丽杰、闫锡钊、王洋、陈丽荣、陈允恩进行数据收集和整理；马冬、李鸥进行论文的修订、文章的质量控制及审校和对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：陈素芳)

WANG Xin-yue1，MA Dong1，ZHANG Qi1，CHANG Ling-ya1，ZHANG Li-jie1，YAN Xi-zhao1，WANG Yang1，CHEN Li-rong2，CHEN Yun-en1，LI Ou3*

1.North China University of Science and Technology，Tangshan 063000，China 2.Qianxi Hospital of Traditional Chinese Medicine，Qianxi 063000，China 3.Tangshan Workers′ Hospital，Tangshan 063000，China

*Corresponding author：LI Ou，Professor；E-mail：tsliou@163.com

Uterine cervical neoplasms；CD56；Interferon-gamma；Prognosis

国家自然科学基金资助项目(81541149)；河北省自然科学基金资助项目(H2016209046)

R 737.33

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.00.007

2017-01-24；

2017-06-15)

1.063000河北省唐山市，华北理工大学

2.063000河北省唐山市迁西县中医院

3.063000河北省唐山市，唐山工人医院

*通信作者：李鸥，教授；E-mail：tsliou@163.com