低碱性磷酸酶血症一家系临床与基因分析

卢维城 石聪聪 蔡 东 郑 旭 郝 虎 肖 昕

1.海南省人民医院新生儿科（海南海口 570311）；2.中山大学附属第六医院儿科（广东广州 510655）

低碱性磷酸酶血症一家系临床与基因分析

卢维城 石聪聪 蔡 东 郑 旭 郝 虎 肖 昕

1.海南省人民医院新生儿科（海南海口 570311）；2.中山大学附属第六医院儿科（广东广州 510655）

目的探讨组织非特异性碱性磷酸酶（TNSALP） 基因检测在低碱性磷酸酶血症（HPP）产前诊断中的作用。方法回顾分析1例新生儿HPP患儿的临床资料，以及全外显子组测序检测TNSALP基因结果；采集家系成员外周血，及患儿母亲第2胎孕17周胎儿的羊水细胞，进行候选基因突变的Sanger测序验证。结果患儿，男性、6日龄，主要表现为多发性骨折，肢体缩短弯曲，呼吸困难，生后9天死于呼吸衰竭；血清碱性磷酸酶下降，血钙轻度下降，血磷正常，血清25羟维生素-D和甲状旁腺激素均正常；X线显示全身骨骼严重矿化不良，长骨干骺端增大呈杯口状，多发性骨折；基因测序结果显示患儿TNSALP基因存在一复合杂合性错义突变，分别为位于第6外显子内的杂合性错义突变c.542C＞T导致第181位氨基酸由丝氨酸突变为亮氨酸（p.S181L），第10外显子内杂合性错义突变c.1016G＞A导致第339位氨基酸甘氨酸突变为谷氨酸（p.G339E）；患儿父母表型均正常，c.542C＞T突变遗传自父亲，c.1016G＞A突变遗传自母亲。胎儿未检出这两种突变。结论TNSALP基因分析可应用于HPP的诊断以及产前诊断。

低碱性磷酸酶血症； 组织非特异性碱性磷酸酶基因； 突变； 产前诊断

低碱性磷酸酶血症（hypophosphatasia，HPP）是一种罕见的代谢性骨病，以广泛骨骼、牙齿矿化障碍及组织非特异性碱性磷酸酶（tissue-nonspecific alkaline phosphatase，TNSALP)活性低下或消失为特征，该病是由组织非特异性碱性磷酸酶基因突变导致的系统性疾病[1]，重症病例死亡发生率高达50%～100%。本研究拟通过对1例新生儿HPP患儿的临床、生化和基因检测结果的分析，探讨HPP诊断以及产前诊断。

1 临床资料

患儿，男，6日龄，因“生后双上肢畸形，气促、发绀6天”入院。患儿G1P1，孕41周顺产，出生体质量3 650 g，羊水、胎盘、脐带无异常，Apgar评分10分；孕期正规产检未发现任何异常。父母均为蒙古族，非近亲结婚，健康状况良好，否认家族遗传病史。体格检查：体温36.5 ℃，呼吸66次/min，脉搏168次/min，收缩压/舒张压（SBP/DBP）86/48 mmHg，体质量3.69 kg，头围36 cm，身长48 cm，神志清，精神反应好，面容无特殊；颅骨软化，触之有乒乓球样感；四肢短，双上肢成角畸形，该处皮肤呈环形深凹切迹，活动障碍。胸廓无明显畸形，呼吸促，脱氧发绀明显，双肺闻及湿性啰音，心音有力，心脏未闻及杂音。实验室检查：血钙1.85 mmol/L (2.25～2.80 mmo/L)，血磷2.82 mmol/L(0.90～1.34 mmol/L)，血清碱性磷酸酶26.0 U/L，血清甲状旁腺激素31.80 pg/mL，血清25羟维生素D 20 ng/mL，血串联质谱和尿气相色谱-质谱分析无异常。彩色多普勒超声心动图示房间隔缺损，动脉导管未闭。肾脏B超示双肾未见钙质沉着。X线检查示广泛性骨骼骨化不全，干骺端增大呈杯口状扩展，多发骨质缺损，双侧桡骨、尺骨、肋骨骨折，见图1。入院初步诊断遗传代谢性骨病，新生儿肺炎，房间隔缺损，动脉导管未闭，给予鼻塞持续气道正压辅助通气、抗感染等治疗后患儿呼吸困难逐渐加重，氧合恶化，血气提示PCO2进行性升高（79.0～118.9 mmHg），家长放弃治疗后当日死亡。

图 1 患儿影像学改变

为进一步明确诊断，经医院伦理委员会审核，患儿家长知情同意，采集患儿及家系成员外周血2 mL（EDTA抗凝血），对患儿行全外显子组测序，结合Sanger 测序验证。使用BloodGen Midi Kit (CWBIO，China) 提取患儿全基因组DNA后对患儿DNA样本进行外显子测序分析，参考文献与OMIM数据库信息，将与全部已知单基因遗传病相关基因（共3 409种）的基因组外显子区域定制罗氏NimbleGen捕获探针进行目标基因全外显子捕获、建库。采用Illumina HiSeq 2500 平台对全基因组编码区外显子进行测序，测序数据量为9 313 Mb，目标区域覆盖度99.83%，原始数据由Flexbar 软件进行初步分析。测序数据通过Burrows-Wheeler Aligner与NCBI RefSeq进行匹配比对，通过DYDF's Analysis Pipline参照hg19人类基因组参考序列进行行注释；通过Provean软件以及SIFT软件进行突变预测注释。通过质量控制、频率及变异类别的筛选以及与疾病的相关关系，筛选出可能致病突变。根据候选致病基因所验证位点序列设计引物，采用PCR方法进行扩增，引物序列见表1。PCR扩增产物用ABI 3730XL测序仪测序，基因序列分析采用DNASTAR软件进行序列分析和比对。经全外显子组检测和Sanger验证显示，患儿TNSALP基因存在一复合杂合突变，包括c.542C＞T和c.1016G＞A。c.542C＞T错义突变位于第6外显子内，即编码区第542位碱基由C突变为T，导致其编码的氨基酸序列第181位由丝氨酸突变为亮氨酸（p.S181L），该突变遗传自其父亲（图2A）。c.1016G＞A错义突变位于第10外显子内，即编码区第1016碱基由G突变为A，导致其339位氨基酸由甘氨酸突变为谷氨酸（p.G339E），该突变遗传自其母亲（图2B）。患儿父母表型均正常。在患儿母亲再次妊娠第17周时，抽取羊水并提取胎儿DNA针对已知的突变位点采用Sanger法进行检测，未检出这两种突变，胎儿四维彩色超声亦未发现骨骼异常。

表1 TNSALP基因分析引物序列及扩增条件

2 讨论

HPP（OMIM 241510，241500，146300）是一种罕见的常染色体显性或隐性遗传病，其典型症状为骨骼和牙齿矿化不全以及血清碱性磷酸酶活性降低，临床表现轻重不一，重症低磷酸脂酶血症多发生于新生儿或婴儿，发病率约为1/100 000，通常为常染色体隐性遗传；轻症HPP则更为常见，多见于儿童或成年人，在欧洲发病率为1/6 370[2]，可以是显性或隐性遗传[3,4]，该病由位于1号染色体编码的TNSALP基因突变所致，TNSALP基因定位于 1p36.12，约50 kb大小，包含12个外显子，编码蛋白由507个氨基酸组成[4]。TNSALP主要的生物学功能是水解细胞外底物无机焦磷酸盐、磷酸吡哆醛和磷酸乙醇胺，TNSALP对骨骼的矿化至关重要，其活性降低将导致无机焦磷酸盐等多种底物蓄积，而矿化抑制剂无机焦磷酸盐在骨骼蓄积将导致佝偻病或骨软化[5]。TNSALP基因突变导致骨组织中TNSALP活性下降而造成的骨骼及牙齿发育缺陷及矿化异常。截止2017年1月7日已报道323种突变（http://www.sesep.uvsq.fr/03_hypo_mutations.php），73.6%为错义突变，其他突变包括小缺失、小插入、剪接异常等，HPP突变主要位于编码区，95%的重型病例（围生型和婴儿型）经全外显子组测序可发现TNSALP基因突变，但约5%的重症病例利用常规PCR扩增及测序方法检测不到外显子及附近内含子两侧基因异常[6]，推测可能是内含子和启动子区域发生了变化，或拷贝数的变化，或大片段基因缺失等[7，8]。突变类型和突变位点的多样性是HPP 临床症状复杂多样的主要原因，突变后的TNSALP酶活性的高低与低磷酸脂酶血症症状的严重程度相关[9，10]。

图2 TNSALP基因测序图

HPP是一种异质性较强的遗传性疾病，临床表现差异很大[11]，根据患儿最早出现症状的年龄和骨骼病变的严重程度分为6 型[12]：围生期致死型、围生期良性型、婴幼儿型、儿童型、成年型及牙型，各型之间的临床表现相互重叠。HPP的预后主要取决于骨骼的损害，一般来说症状和体征出现越早预后越差[13]。围生期致死型HPP是预后最差的一型，宫内即出现广泛的骨骼矿化障碍，前臂或腿部有皮肤包裹的骨/软骨刺突出，生后出现惊厥、呼吸暂停，此型可出现死产或生后数天内死亡，主要死于肺发育不良或佝偻病样胸廓畸形导致的呼吸衰竭，其次是难治性惊厥[14]。本例患儿为中国蒙古族男性，其父母表型均正常，非近亲结婚，家族无类似病史，临床主要表现为多发性病理性骨折、肢体活动障碍、呼吸困难、放射影像学显示骨骼广泛的矿化不良、佝偻病样改变伴有病理性骨折，血清碱性磷酸酶明显降低，经全外显子组测序和一代测序验证显示患儿TNSALP基因存在复合杂合突变，最终诊断围生期致死型HPP。目前已报道的HPP均为纯合子点突变或复合杂合子突变，围生型HPP和婴儿型HPP通常为复合杂合子突变[15]，偶有纯合子[16]。本例患儿亦为复合杂合子突变。本研究发现的错义突变c.542C＞T为已报道的致病突变[10,17]，突变位于第6外显子内，即编码区542位出现杂合性改变C＞T，导致其编码丝氨酸改变为亮氨酸（p.S181L），父亲也携带相同的杂合突变c.542C＞T，而母亲没有。c.1016G＞A错义突变位于第10外显子内，即编码区1016位点出现杂合性改变G＞A导致甘氨酸改变为谷氨酸（p.G339E），母亲也携带相同的杂合突变，而父亲没有，该突变也是已知的致病突变，最早由Simon-Bouy 等[18]报道；患儿的复合杂合突变分别源自父母，父母均携带一个杂合突变，但表型均正常，符合常染色体隐性遗传方式，即仅有1个等位基因发生改变的只是携带者，而不会出现疾病表型；当患儿出现2个等位基因改变(一个纯合突变或复合杂合突变)时，没有正常的编码蛋白执行正常功能，从而出现临床症状[19]。由于该患儿的同胞中1/4个体有发病的风险，因此母亲再次妊娠进行遗传咨询时，根据先证者的突变类型进行产前诊断，羊水穿刺基因检测显示本次怀孕胎儿未携带这两种突变，不存在HPP。

HPP是一种需要与许多疾病鉴别的罕见病，不同类型的HPP临床表现差异很大，诊断有时不易，不能仅依据生化指标，需要结合患者临床表现、影像学检查和实验室指标进行判断，否则易误诊[20]，确诊最终有赖于基因检测。相对比较敏感的生化指标是血清或骨碱性磷酸酶下降，尿磷酸乙醇胺升高，血清5’-磷酸吡哆醛升高，但这些指标均为非特异性指标[13]，即使是在HPP的患者，碱性磷酸酶也可在正常范围[21]。本研究选择高通量的二代测序技术对患儿样本进行全外显子组测序基于以下原因：首先患儿疑似诊断为HPP，但仍需与其他遗传代谢性骨病鉴别，其次由于HPP已知致病基因TNSALP包含12个外显子的编码序列，已经有多个已知突变位点被鉴定，用Sanger测序法对已知突变进行逐一筛选将消耗大量的时间和财力。

国内迄今尚无关于围生期致死型HPP的报道，产前诊断的研究也很少，有少数婴儿型HPP及基因分析报道[19,22]。本研究通过分析患者的临床特征、常规生化和特定遗传生化代谢特点，并结合基因分析、家系和产前分析，进行了初步的研究，基因检测显示TNSALP基因的1个复合杂合突变c.542C＞T突变和c.1016G＞A 突变是该家系HPP患儿的致病基因，TNSALP基因分析可应用于HPP产前诊断，但由于病例数量不多，而且目前分析报道的家系及基因分析比较少，还需积累更多的病例及家系，以便为有家族史的个体进行产前诊断和遗传咨询提供理论依据。

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(本文编辑：邹 强)

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Clinical and genetic analysis of a family with low alkaline phosphatase

LU Weicheng1, SHI Congcong2, CAI Dong1,ZHENG Xu1, HAO Hu2, XIAO Xin2(1.Department of Neonatology, Hainan People’s Hospital, Haikou 570311, Hainan, China;2.Department of Pediatrics, The Sixth Affiliated Hospital of SunYat-Sen University, Guangzhou 510655, Guangdong, China)

ObjectiveTo investigate the role of TNSALP gene detection in prenatal diagnosis of HPP. Method The clinical data and the results of complete exon sequencing of TNSALP gene in one neonate with low alkaline phosphatase (HPP)were analyzed retrospectively. Peripheral bloods from his family members were collected. The amniotic fluid cell in fetuses at 17 weeks was tested for candidate gene mutations by Sanger sequencing.ResultsMainly manifestations in 6-day-old baby were multiple fractures, limb shortening and bending and dyspnea. He died of respiratory failure 9 days after birth. The serum alkaline phosphatase was decreased and serum calcium was decreased slightly; serum phosphorus, serum 25 hydroxyvitamin-D and parathyroid hormone were normal. X-ray showed that the whole body bone was very poorly mineralized, and the long diaphysis was enlarged with shape of a cup at the end and multiple fractures existed. Gene sequencing revealed a complex heterozygous missense mutation in the TNSALP gene, including the heterozygous missense mutation c.542C＞T in exon sixth causing 181st amino acids changed from serine to leucine (p.S181L), and tenth exon heterozygous missense mutation in c.1016G＞A causing 339th amino acid changed from glycine to glutamic acid (p.G339E). The parental phenotypes were normal. The c.542C＞T mutation is inherited from his father and the c.1016G＞A mutation is inherited from his mother. These two mutations were not detected in the fetus. Conclusion TNSALP gene analysis can be applied to the diagnosis and prenatal diagnosis of HPP.

low alkaline phosphatase; tissue nonspecific alkaline phosphatase gene; mutation; prenatal diagnosis

2017-02-13)

10.3969/j.issn.1000-3606.2017.09.012

肖昕 电子信箱：txiaoxin1049@163.com