冰片对氟苯尼考血浆蛋白结合率的影响

李旭廷，李思聪，周 芳，杨 锐，王 斌

(四川省畜牧科学研究院/动物遗传育种四川省重点实验室，四川成都 610066)

冰片对氟苯尼考血浆蛋白结合率的影响

李旭廷，李思聪，周 芳，杨 锐，王 斌

(四川省畜牧科学研究院/动物遗传育种四川省重点实验室，四川成都 610066)

为研究冰片对氟苯尼考血浆蛋白结合率的影响，采用超滤法结合超高效液相色谱法，比较未加冰片和加入冰片后氟苯尼考的血浆蛋白结合率。25、5 、1 μg/mL三种浓度下，氟苯尼考血浆蛋白结合率分别为牛23.68%±1.25%、25.26%±1.42%、26.46%±1.48%，大鼠31.33%±1.82%、32.32%±1.46%、34.15%±1.59%，家兔15.69% ±1.45%、19.31%±1.26%、24.38%±1.51%，肉鸡21.68% ±1.37%、20.13%±1.84%、20.52%±1.77%,猪30.08%±1.03%、31.02%±1.28%、30.56%±1.55%。氟苯尼考5 μg/mL浓度下与冰片合用,血浆蛋白结合率无显著变化。结果表明，氟苯尼考有较低的血浆蛋白结合率，冰片对氟苯尼考血浆蛋白结合率无显著影响。

超滤法；冰片；氟苯尼考；蛋白结合率；高效液相色谱法

氟苯尼考(florfenicol)是美国先灵-葆雅(Schering-Plough)公司20世纪80年代研制开发的兽用广谱抗菌药，为新型的氯霉素类抗菌药，其特点是抗菌谱广、吸收良好、体内分布广泛，无潜在的致再生障碍性贫血作用[1]，目前广泛应用于畜禽及水产养殖中敏感菌引起的感染性疾病的防治[2-5]。冰片作为传统引经药物，具有“芳香走窜、引药上行”的功能，临床上常与他药联用，促进药物吸收、透过“血脑屏障”等[6-10]。尽管冰片与其他药物联用的药物-药物影响研究较多，但少有冰片对药物血浆蛋白结合率影响的报道。鉴于冰片作为养殖临床应用非常广泛的一类中药，与氟苯尼考等兽用抗菌药物联合应用的可能性与日俱增，有必要开展冰片对氟苯尼考血浆蛋白结合率影响的研究，以期为临床安全、合理配伍使用药物提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器设备 Ultimate 3000 型高效液相色谱仪系统，美国戴安公司产品；Sartorius BD211D电子天平，德国塞多利斯产品；KQ-300VDE双频数控超声清洗器，昆山市超声仪器有限公司产品；XW-80A微型涡旋混合仪，上海市沪西分析仪器厂有限公司产品；TGL-16G 高速离心机，上海安亭科学仪器厂产品；Eppendorf Research○Rplus精密移液器，艾本德中国有限公司产品；Amicon○RUltra-0.5mL型超滤管(10K),密理博公司产品。

1.1.2 药品与试剂 氟苯尼考对照品(含量99.3%，批号K0301305)，中国兽医药品监察所产品；冰片(龙脑含量65.0%，批号20150801)，广州化工有限公司产品；牛血清白蛋白(BSA)，美国Sigma公司产品；甲醇、乙腈(色谱纯)，艾万拓化工产品贸易(上海)有限公司产品；乙酸铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠，均为分析纯，成都科龙化工试剂厂产品；纯化水为四川省畜牧科学研究院兽药研究所自制。

1.1.3 试验用动物 SD大鼠(200 g±20 g)，成都达硕实验动物中心产品(许可证号SYXK(川)2014-189)；新西兰兔(1.8 kg±0.4 kg)，四川鼎鑫兔业有限公司产品；大恒肉鸡(1.2 kg±0.2 kg)，四川大恒家禽有限公司产品；外三元猪(25.5 kg±5.8 kg)，四川省畜牧科学研究院试验猪场产品；以上试验用动物均为雄性。大鼠采用毛细管眼眦取血，家兔采集心血，肉鸡翅下静脉采血，猪前腔静脉采血，3 000 r/min离心10 min，分离血浆，置于4℃冰箱中备用。

1.2 方法

1.2.2 溶液的配制

1.2.2.1 氟苯尼考标准品储备液配制 精密称取氟苯尼考标准品5 mg，于10 mL容量瓶中，加PBS至刻度，超声20 min溶解，得500 μg/mL标准品储备液，依次稀释成100 μg/mL和20 μg/mL标准品储备液，4℃冷藏备用。

1.2.2.2 冰片溶液配制 精密称取冰片250 mg，于50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，超声20 min溶解，得5 mg/mL冰片溶液，依次稀释成1 mg/mL和0.2 mg/mL冰片储备液，4℃冷藏备用备用。

1.2.2.3 磷酸缓冲溶液(PBS)的配制 称取十二水磷酸氢二钠19.028 g，磷酸二氢钠2.08 g，氯化钠4.4 g，加水至1 000 mL，即得pH 7.4 的等渗PBS溶液。

1.2.3 专属性考察 取400 μL空白动物血浆置于超滤管中，37℃孵育2 h，12 000 r/min离心20 min，得空白血浆超滤液。分别对氟苯尼考标准品、空白血浆超滤液、空白血浆超滤液+氟苯尼考标准品进样20 μL。

1.2.4 标准曲线的制备 精密吸取浓度为100 μg/mL氟苯尼考标准品储备液适量，PBS缓冲液梯度稀释为质量浓度分别为100、20、5、1、0.1 μg/mL标准系列溶液，均进样20 μL，以峰面积(A)对标准品浓度(C，μg/mL) 进行线性回归，绘制标准曲线。

1.2.5 精密度和回收率考察 考察取PBS配制50、10、1 μg/mL 的高、中、低3种浓度的氟苯尼考对照品溶液，1 d内分别测定5次，连续测定5 d，计算日内和日间精密度。

另取PBS配制浓度为50、10、1 μg/mL 3 个浓度的氟苯尼考标准品溶液各400 μL置于超滤管，37℃孵育2 h，12 000 r/min离心20 min，取超滤液20 μL进样测定，与对照品溶液峰面积对比计算回收率。

CT增强扫描：医护人员在CT检查前应叮嘱患者身上不得放置金银首饰，处于空腹状态，并指导患者做好呼吸运动训练，以维持良好的呼吸频率与深度，需要注意的是，应严格按照相关规定进行碘过敏试验。之后借助CT扫描机进行动态增强扫描，向肘静脉内注入碘帕醇注射液，注入速度控制在3.0mL/s，注入剂量控制在65mL，注射对比剂后扫描时间选择为：20s、80s、140s、200s、260s，扫描范围主要包括肿块及其周围5mm范围内，同时统计计算灌注参数，主要包括血流量、血容量、通过时间以及表面渗透性。

1.2.6 血浆蛋白结合率试验

1.2.6.1 氟苯尼考血浆蛋白结合率测定 精密吸取50 μL浓度为500、100 、20 μg/mL的氟苯尼考标准品溶液加至950 μL血浆的洁净离心管中，配制成浓度为25、5、1 μg/mL的血浆待测样本，涡旋15 s，37℃孵育2 h，分别取400 μL血浆待测样本于超滤管中，12 000 r/min离心20 min，取超滤液20 μL进样检测。每种浓度平行5份。

1.2.6.2 冰片浓度对氟苯尼考溶液血浆蛋白结合率影响 精密吸取5 μL浓度为5、1、0.2 mg/mL冰片溶液，加至945 μL血浆的洁净离心管中，涡旋15 s，再加入50 μL浓度为100 μg/mL的氟苯尼考标准品溶液，涡旋15 s，37℃孵育2 h，配制成含每毫升分别含25、5、1 μg冰片并含5 μg氟苯尼考的血浆待测样本。分别取400 μL血浆待测样本于超滤管中，12 000 r/min离心20 min，取超滤液20 μL进样检测。每种浓度平行5份。

1.2.6.3 血浆蛋白结合率计算 参照文献[11-12]进行。

血浆蛋白结合率/%=(血浆中药物总浓度Ct-游离药物浓度Cf)/血浆中药物总浓度Ct × 100，计算氟苯尼考的血浆蛋白结合率。

2 结果

2.1 专属性

在所采用的色谱条件下，氟苯尼考保留时间在16.7 min左右，峰形良好，无杂质峰干扰，具有较高的专属性。

2.2 标准曲线

以浓度C为横坐标，峰面积A为纵坐标，进行线性回归，结果表明在0.1 μg/mL～100 μg/mL范围内线性关系良好，回归方程为A=0.961 8C-0.026 8(R2=0.999 9)。

2.3 精密度与回收率

根据随行标准曲线，计算各成分浓度，求得日内精密度、日间精密度和回收率。结果表明，方法的准确度和精密度良好，符合生物样本分析的要求，超滤膜对不同浓度氟苯尼考平均吸附率小于3%，对氟苯尼考无特异性吸附，回收率良好(表1)。

表1 氟苯尼考精密度和回收率结果

2.4 氟苯尼考血浆蛋白的结合率

高、中、低3种浓度氟苯尼考血浆样品(25、5、1 μg/mL)与不同动物血浆蛋白结合率测定结果见表2。从表2可见，氟苯尼考血浆蛋白平均结合率从高到低依次为大鼠32.60%、猪30.55%、BSA25.28%、家兔19.80%、肉鸡20.78%，且种属之间差异显著(P<0.05)。5 μg/mL氟苯尼考浓度条件下加入不同浓度(25、5、1 μg/mL)冰片溶液后，氟苯尼考血浆蛋白平均结合率分别为大鼠31.53%、猪31.18%、BSA 25.30%、家兔17.68%、肉鸡19.32%，与单独使用氟苯尼考无明显变化(P>0.05)(表3)。

表2 不同浓度氟苯尼考血浆蛋白结合率

注：角标相同字母表示差异不显著(P>0.05)；不同写字母表示差异显著(P<0.05))。

Note：The same letters indicate no significant difference in the same column(P>0.05),and with different letters mean significant difference(P<0.05).

表3 冰片对氟苯尼考血浆结合率影响

3 讨论

研究药物血浆结合率的方法有超滤法、平衡透析法、超速离心法、凝胶过滤法等，其中较常用的为平衡透析法与超滤法，但前者耗时较长，可能引起药物代谢降解，对药物蛋白结合率的测定造成较大误差[13-14]。超滤法因设备简单，操作简便、耗时短、血浆样本需求量少等优点，已广泛应用于药物血浆蛋白结合率测定试验[15-19]。本试验选择超滤法，考察了药物模拟动物机体体温37℃的孵育时间，发现氟苯尼考在温孵2 h 时，与蛋白达到结合平衡状态。同时，还研究了超滤离心的转速和时间，根据不漏蛋白，而且超滤液体积与超滤前总体积之比为0.3～0.6为宜的标准[11]，最终确定离心时间为20 min，转速为12 000 r/min。因选择甲醇作为冰片溶剂，本试验考察了不同体积甲醇对氟苯尼考血浆蛋白结合率影响，试验发现20 μL以上体积的甲醇加入到950 μL体积血浆中，氟苯尼考蛋白结合率下降18.5%～22.7%，为避免甲醇的干扰，各冰片组添加量最终确定为5 μL(血浆中甲醇体积比约占5‰)。

据文献报道[20-26]，无论口服还是注射途径给药，氟苯尼考推荐剂量一般为10 mg/kg～30 mg/kg体重，动物体内血药浓度峰值在2 μg/mL～25 μg/mL。本试验选择25、5、1 μg/mL 3个氟苯尼考浓度符合临床用药实际。

目前，尚无氟苯尼考与大鼠血浆蛋白结合率的公开报道。本试验显示，氟苯尼考与大鼠血浆蛋白和猪血浆蛋白结合率平均值分别为32.60%和30.55%，高于BSA(25.26%)、兔(19.80%)、鸡(20.78%)(P<0.05)。试验中氟苯尼考BSA结合率为25.26%，与Bretzlaff K N等[23]报道一致，Bretzlaff K N等采用平衡透析法和超滤法分别测定50 μg/mL和5 μg/mL浓度条件下氟苯尼考和牛血浆蛋白结合率，得出平衡透析法为19%和18%，超滤法为19%和23%，二者差异不显著。本试验测定的氟苯尼考鸡血浆蛋白结合率为20.78%，与Afifi N A等报道[22]的氟苯尼考鸡血浆蛋白结合率为18.5%接近。而新西兰兔血浆蛋白结合率为19.80%比Abd ElAty A M等报道[24]的氟苯尼考兔血浆蛋白结合率为11.65%略高，应与选择的试验方法和动物具体品种有一定关系。同一动物不同亚种或不同品系血浆蛋白构成和含量是否影响药物结合率值得进一步研究探索。

本试验建立了超滤法结合超高效液相色谱法测定氟苯尼考血浆蛋白结合率的方法，试验中未观测到冰片对氟苯尼考血浆蛋白结合率有显著影响，未来将进一步考察冰片对氟苯尼考药代动力学和组织分布变化情况。

[1] 邱银生,吴 佳.兽用广谱抗菌药物氟甲砜霉素[J].中国兽药杂志,1996，30(2):47-48.

[2] Priebe S,Schwarz S.Invitroactivities of florfenicol against bovine and porcine respiratory tract pathogens[J].Antimicrob Agent Chemother,2003,47(8):2703-2705.

[3] 陈晓慧,刘明春,焦 阳.氟苯尼考的研究应用进展[J].中国家禽,2006,28(14):50-52.

[4] 赵汉取,王雨晨,韦肖杭,等.新一代抗生素——氟苯尼考及其在水产养殖中的应用[J].水产科技情报,2007,34(4):165-168.

[5] 潘红艳,宫智勇.氟苯尼考的研究进展及临床应用[J].湖北农业科学,2011,50(2):229-232.

[6] 肖衍宇,陈志鹏,平其能,等.冰片对川芎嗪促吸收作用的研究[J].药学学报,2009，44(8):915-921.

[7] 周红宇,王 萍,林 丹,等.冰片对卡马西平在家兔体内药代动力学的影响[J].中国药理学通报,2005(10):1263-1266.

[8] He H,Shen Q,Li J.Effects of borneol on the intestinal transport and absorption of two P-glycoprotein substrates in rats[J].Arch Pharmacal Res,2011,34(7):1161-1170.

[9] Cai Z,Hou S,Li Y,et al.Effect of borneol on the distribution of gastrodin to the brain in mice via oral administration[J].J Drug Targeting,2008,16(2):178-184.

[10] Renzhong W,Yanyan X,Yanping L,et al.Enhancing effects of different dosages of borneol on pharmacokinetics of salvanic acid B after oral administration to rats [J].J Asian Nat Product Res,2012,14(6):538-544.

[11] 韩雪莹,王 巍,谭日秋,等.超滤法测定牛蒡苷及牛蒡苷元的血浆蛋白结合率[J].中国中药杂志,2013,38(3)：432-434.

[12] 陈 豆,涂 星,张英丰.超滤法测定丹酚酸A的血浆蛋白结合率[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(2):77-80.

[13] 关 瑾,丁 爽,刘芷含,等.药物-血浆蛋白结合率测定方法的研究进展[J].中国新药杂志,2014,23(10):1149-1153.

[14] Taylor S,Harker A.Modification of the ultrafiltration technique to overcome solubility and non-specific binding challenges associated with the measurement of plasma protein binding of corticosteroids[J].J Pharmaceu Biomed Analy,2006,41(1):299-303.

[15] 徐卫康,祝文琪,周旭平,等.连翘酯苷在IBV感染雏鸡与正常雏鸡血浆中蛋白结合率的比较[J].动物医学进展,2013,34(5):55-58.

[16] 王 立,任君刚.超滤法测定表没食子儿茶素没食子酸酯人血浆蛋白结合率[J].中国药学杂志,2008,43(20):1579-1581.

[17] Wang C,Williams N S.A mass balance approach for calculation of recovery and binding enables the use of ultrafiltration as a rapid method for measurement of plasma protein binding for even highly lipophilic compounds[J].J Pharmaceu Biomed Analy,2013,75(5):112-117.

[18] Tang D,Li Y,Li Z,et al.Study on the interaction of plasma protein binding rate between edaravone and taurine in human plasma based on HPLC analysis coupled with ultrafiltration technique[J].Biomed Chromatogra,2014,29(8):1137-1145.

[19] 宁 慧,莫 微.校正超滤法测定木香烃内酯和去氢木香内酯的大鼠血浆蛋白结合率[J].中国现代中药,2015,17(4):321-325.

[20] Varma K J,Adams P E,Powers T E,et al.Pharmacokinetics of florfenicol in veal calves[J].J Vet Pharmacol Therap,1986,9(4):412-425.

[21] Samuelsen O B,Bergh O,Ervik A.Pharmacokinetics of florfenicol in cod Gadus morhua andinvitroantibacterial activity against Vibrio anguillarum[J].Disea Aquatic Organ,2003,56(2):127-133.

[22] Afifi N A,Abo el-Sooud K A.Tissue concentrations and pharmacokinetics of florfenicol in broiler chickens[J].Bri Poult Sci,1997,38(4):425-428.

[23] Bretzlaff K N,Neff-Davis C A,Ott R S,et al.Florfenicol in non-lactating dairy cows:pharmacokinetics,binding to plasma proteins,and effects on phagocytosis by blood neutrophils[J].J Vet Pharmacol Therap,1987,10(3):233-240.

[24] Abd ElAty A M,Goudah A,Abo E K,et al.Pharmacokinetics and bioavailability of florfenicol following intravenous,intramuscular and oral administrations in rabbits[J].Vet Res Commun,2004,28(6):515-524.

[25] Atef M,Elgendi A Y,Amer A M M,et al.Pharmacokinetic properties of florfenicol in Egyptian goats[J].Dtw Deutsche Tierarztliche Wochenschrift,2000,107(4):147-150.

[26] Lobell R D,Varma K J,Johnson J C,et al.Pharmacokinetics of florfenicol following intravenous and intramuscular doses to cattle[J].J Vet Pharmacol Therap,1994,17(4):253-258.

EffectsofBorneolonPlasmaProteinBindingRatesofFlorfenicol

LI Xu-ting,LI Si-cong,ZHOU Fang,YANG Rui，WANG Bin

(SichuanKeyLaboratoryofAnimalGeneticsandBreeding/SichuanAnimalScienceAcademy,Chengdu,Sichuan，610066,China)

To investigate the effect of borneol on the plasma protein binding rates (PPBR) of florfenicol,the ultrafiltration combined with UHPLC was employed to determine the PPBR of florfenicol with rat, rabbit, chicken, pig and bovine plasma. The PPBR of florfenicol with rat plasma at the concentrations of 25,5,1 μg/mL were(23.68%±1.25%，25.26%±1.42%,26.46%±1.48%)with BSA，(31.33%±1.82%,32.32%±1.46%，34.15%±1.59%) with rat plasma protein，(15.69% ±1.45%，19.31%±1.26%，24.38%±1.51%) with rabbit plasma protein，(21.68% ±1.37%，20.13%±1.84%，20.52%±1.77%) with chicken plasma protein, and (30.08%±1.03%，31.02%±1.28%，30.56%±1.55%) wiht pig plasma protein, respectively.The plasma protein binding rate of florfenicol was low in all species and no concentration dependence was evident.The results indicated that borneol did not influence the PPBR of florfenicol.

ultrafiltration;borneol;florfenicol;protein binding rate;UHPLC

2017-01-16

四川省财政运行专项项目(SASA2014CZYX010)；四川省科技支撑计划项目(16ZC2945)

李旭廷(1977-)，男，四川简阳人，副研究员，学士，主要从事中兽药研究。

S859.7

:A

:1007-5038(2017)09-0014-05