氯吡格雷对大鼠心肌缺血/再灌注心肌细胞凋亡及氧自由基的作用及机制

徐 玲 蔡银链 许朝祥

(福建医科大学附属第二医院心内科，福建 泉州 362000)

氯吡格雷对大鼠心肌缺血/再灌注心肌细胞凋亡及氧自由基的作用及机制

徐 玲 蔡银链 许朝祥

(福建医科大学附属第二医院心内科，福建 泉州 362000)

目的观察体外给予氯吡格雷干预对大鼠心肌缺血/再灌注损伤(MIRI)心肌细胞凋亡与氧自由基的作用，分析其机制。方法Wistar大鼠120只随机分为假手术组(Sham组)、MIRI组及治疗组(给予氯吡格雷干预)各40只，观察各组心肌酶学指标，心脏梗死面积，组织病理学改变，Caspase-3及程序性细胞凋亡因子(PDCD)-5表达及超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)含量变化情况。结果在组织病理学方面，光镜下可见，Sham组细胞结构完整，横纹清楚，排列整齐。MIRI组细胞排列紊乱，坏死严重。治疗组细胞存在细胞水肿现象，但横纹较MIRI组清楚。与Sham组相比，MIRI组及治疗组乳酸脱氢酶(LDH)及磷酸肌酸肌酶(CPK)含量显著升高(P<0.05)；与MIRI组相比，治疗组LDH及CPK含量显著降低(P<0.05)。与Sham组相比，MIRI组及治疗组心脏梗死面积显著升高(P<0.05)；与MIRI组相比，治疗组心脏梗死面积显著降低(P<0.05)。光镜下，Sham组基本未见Caspase-3及PDCD-5阳性细胞；MIRI组随处可见大量Caspase-3及PDCD-5阳性细胞；相比于Sham组，治疗组Caspase-3及PDCD-5阳性细胞含量明显增加，但相对于MIRI组，治疗组阳性细胞含量明显降低(P<0.05)。与Sham组相比，MIRI组及治疗组SOD含量显著降低，MDA含量显著升高(P均<0.05)；与MIRI组相比，治疗组SOD含量显著降低，MDA含量显著升高(P均<0.05)。结论氯吡格雷可缩小心肌梗死面积，减轻水肿情况，抑制Caspase-3及PDCD-5凋亡因子的生成，降低心脏内氧自由基分泌从而达到保护大鼠心脏功能，改善MIRI。

氯吡格雷；缺血/再灌注损伤；Caspase-3；程序性细胞凋亡因子(PDCD)-5；细胞凋亡；超氧化物歧化酶(SOD)；丙二醛(MDA)

冠心病发病过程中，心肌缺血再灌注损伤(MIRI)导致的细胞凋亡是冠心病损伤的重要机制之一，而最大程度的抑制凋亡已经成了治疗的关键〔1〕。研究证实，Caspase蛋白酶是与凋亡关系最为密切的因子之一，可水解底物蛋白，降解细胞内产物，导致染色体断裂，最终使细胞走向死亡，其中Caspase-3是该家族中最为关键的因子〔2〕。程序性细胞凋亡因子(PDCD)-5是与凋亡相关因子，研究发现其在多种疾病中起着重要作用〔3〕。氯吡格雷是近几年应用于临床中治疗冠心病的药物，其可通过拮抗二磷酸腺苷发挥抗血小板作用，从而发挥药物作用〔4〕。本研究构建老年MIRI大鼠，给予氯吡格雷干预，观察该疗法改善心肌细胞凋亡的作用。

1 资料与方法

1.1动物模型构建及分组 参考相关文献〔5〕，建立MIRI大鼠模型。7.2%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，行气管切开并给予人工通气，并连接小动物心电图机。胸骨左缘3～5肋间开胸，暴露心脏，于左心耳与肺动脉圆锥交界处下3～4处结扎左前降支，并在冠脉与结扎线之间固定一细管，使细管压迫冠状动脉，心电图出现ST段抬高，说明急性心肌缺血模型诱导成功。压迫45 min后，移除细管，使血液再灌注心脏，心脏颜色变砖红，ST段出现下降一半以上，说明再灌注模型成功。从北京华阜康生物公司购置Wistar大鼠120只，随机分为3组，每组40只，均在构建模型前给予对应干预，分为假手术组(Sham组)，MIRI组和治疗组(给予氯吡格雷干预)。Sham组操作同MIRI组，但只穿线不结扎。治疗组给予氯吡格雷(法国 Sanofi Pharma Bristol-Myers Squibb SNC公司)灌胃，3 mg/kg，喂服5 d。Sham、MIRI组行等量的生理盐水灌胃，再灌注3 h后取大鼠组织及血液进行后续实验。

1.2心脏组织病理形态检测 磷酸盐缓冲液(PBS)灌注后，取大鼠心脏组织，4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脱水，包埋，切片后进行HE染色，光镜下观察心脏组织形态。

1.3心脏梗死面积测定 PBS灌注后，取大鼠心脏组织，做冠状切片，应用2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色测定心脏梗死面积，按照梗死区占整个切片的百分比测定梗死面积。左心耳连接灌流装置，实时监测左心室功能，包括心率，左室发展压及冠脉流量。

1.4免疫组化检测Caspase-3及PDCD-5的表达 将石蜡切片脱蜡，二甲苯透明，梯度酒精脱水，PBS清洗，抗原修复，添加Caspase-3及PDCD-5一抗(购于CST公司)过夜孵育，第2天二抗孵育，室温静置2 h，PBS清洗，二氨基联苯胺(DAB)及苏木精染色，清洗后封片显微镜观察。

1.5血清心肌酶学检测 血清常温静止2 h后，高速12 000 r/min离心15 min，取上清至于新的离心管深冻冰箱保存备用。应用乳酸脱氢酶(LDH)及磷酸肌酸肌酶(CPK)试剂盒(均购于碧云天试剂公司)检测血清心肌酶，严格按照说明书及文献配置多种试剂及显色剂及操作。

1.6超氧化物歧化酶(SOD)检测 应用SOD试剂盒(碧云天试剂公司)，严格按照说明书及文献配置多种试剂及显色剂及操作〔3〕，并应用仪器检测血清吸光度。SOD(U/ml)=(对照管吸光度-测定管吸光度)/对照管吸光度×50%×稀释倍数。

1.7丙二醛(MDA)检测 应用MDA试剂盒(碧云天试剂公司)，采用荧光检测法，严格参照说明书及相关文献配置试剂及标准品〔3〕，试剂混匀后95℃水浴40 min，再流水冲洗，3 500 r/min离心10 min，取血清后测定吸光度。MDA(nmol/ml)=(测定管吸光度-测定空白管吸光度)/(标准吸光度-标准空白管吸光度)×标准品浓度×稀释倍数。

1.8统计学方法 应用SPSS17.0统计软件进行t检验。

2 结 果

2.1各组心脏组织病理形态 见图1。光镜下可见，Sham组细胞结构完整，横纹清楚，排列整齐。MIRI组细胞排列紊乱，坏死严重。治疗组存在细胞水肿现象，但横纹较MIRI组清楚。

图1 各组心脏组织病理形态(×400)

2.2各组血清心肌酶学指标比较 与Sham组相比，MIRI组及治疗组LDH及CPK含量显著升高(P<0.05)；与MIRI组相比，治疗组LDH及CPK含量显著降低(P<0.05)，见表1。

2.3各组心肌梗死率比较 与Sham组〔(0.5±0.019)%〕相比，MIRI组及治疗组心肌梗死率〔(31.6±9.9)%、(14.5±8.9)%〕显著升高(P<0.05)；与MIRI组相比，治疗组心肌梗死率显著降低(P<0.05)。

2.4各组心肌组织Caspase-3及PDCD-5表达 光镜下，Sham组基本未见Caspase-3、PDCD阳性细胞；MIRI组随处可见大量Caspase-3、PDCD阳性细胞；与Sham组比较，治疗组Caspase-3、PPCD阳性细胞含量明显增加，与MIRI组比较，治疗组Caspase-3、PPCD阳性细胞含量明显降低(P<0.05)，见图2、图3。

表1 各组血清心肌酶学指标比较(U/L，±s，n=40)

与Sham组比较：1)P<0.05；与MIRI组比较：2)P<0.05；下表同

图2 各组心肌组织Caspase-3表达(×400)

图3 各组心肌组织PDCD-5表达(×400)

2.5各组SOD及MDA含量比较 与Sham组相比，MIRI组及治疗组SOD含量显著增高，MDA含量显著降低(P<0.05)；与MIRI组相比，治疗组SOD含量显著增高，MDA含量显著降低(P<0.05)，见表2。

表2 各组SOD及MDA含量比较(±s，n=40)

3 讨 论

MIRI是多种心脏疾病，如冠心病、心肌梗死的常见发病原因，致病机制复杂，至今没有明确的机制解释清楚，但尽早地恢复血流是治疗疾病的根本，较长时间的缺血缺氧可导致心肌细胞及组织凋亡坏死。研究表明，3条信号通路可以干预凋亡：①线粒体凋亡通路，线粒体是细胞内主要产能细胞器，为细胞的各种功能和稳态的维持提供能量。该凋亡通路中重要的因子为细胞色素C及c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路相关蛋白，接收到凋亡信号刺激后，细胞质内凋亡蛋白释放，激活下游Caspase-3、PDCD-5等凋亡蛋白，从而诱发了细胞的程序性死亡〔6〕。②内质网凋亡途径，病理因素可导致内质网中Caspase-12的高表达，从而诱发Caspase-3、PDCD-5等凋亡分子的激活〔7〕。③死亡受体通路，多种体外刺激物激活死亡受体，从而诱导细胞内Caspase-3等效应酶，从而引起细胞凋亡〔8〕。在多种凋亡通道中，Caspase-3处于凋亡系统的中心环节，多种因子及通道均可激活Caspase-3分子，从而启动细胞凋亡。线粒体凋亡通路，内质网凋亡途径，死亡受体通路，这三种通路最终都通过激活下游Caspase-3、PDCD-5等凋亡蛋白，从而诱发了细胞的程序性死亡〔8〕。Caspase-3处于凋亡系统的中心环节，多种因子及通道均可激活Caspase-3分子，从而启动细胞凋亡。PDCD-5是新近发现的凋亡因子，其在凋亡过程中起着早期及始动性的功能，PDCD-5可诱发线粒体凋亡通路。与此同时，机体在正常情况下可以清体清除体内多余的自由基，然而在缺血缺氧的情况下，机体内会出现较多的氧自由基的积聚，从而加重心肌组织的损害。SOD是主要的抗氧化酶，能有效地清除体内自由基〔9〕；而MDA与线粒体膜的稳定性呈负相关〔10〕，因此通过测定两者情况可以评估心脏内氧自由基水平。

氯吡格雷作为一种血小板受体阻断剂，因较小的副作用广泛应用于临床，然而有关其调控细胞凋亡的机制仍然不清楚。本研究提示在组织形态方面，氯吡格雷可以显著改善心肌缺血进展。在血清心肌酶学方面，氯吡格雷可以显著改善心脏功能。在SOD及MDA方面比较，提示减弱疾病发展的机制中伴随氧自由基的改善。在凋亡相关因子Caspase-3及PDCD-5表达方面，提示氯吡格雷可以通过降低心肌组织的凋亡情况来改善疾病的发生发展。这一结果首先验证了PDCD-5这一新型因子在凋亡过程中的重要作用，也提示了氯吡格雷的抗凋亡能力，这一结论与国内在冠脉微栓塞模型研究结果吻合〔11〕。氯吡格雷可通过调控血小板功能、炎性细胞因子分泌及患者心功能来改善心脏疾病的发生发展〔12～14〕。本文结果提示，氯吡格雷可以较大程度改善MIRI大鼠心脏功能，并且其机制与减弱心肌凋亡及氧自由基密切相关。

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10Hedayati Kashka R，Zavareh S，Lashkarbolouki T.Augmenting effect of vitrification on lipid peroxidation in mouse preantral follicle during cultivation：modulation by coenzyme Q10〔J〕.Syst Biol Reprod Med，2016；3：1-11.

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〔2016-12-11修回〕

(编辑 苑云杰)

福建省卫生计生青年科研课题(No.2016-1-67)

许朝祥(1970-)，男，硕士，主任医师，主要从事心血管疾病研究。

徐 玲(1983-)，女，硕士，主治医师，主要从事心血管疾病研究。

R363

A

1005-9202(2017)16-3942-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.015