应用CRISPR/Cas9慢病毒系统建立Nestin基因敲除的小鼠肾足细胞系

王璐萍 陶颖莉 黄平⋆

应用CRISPR/Cas9慢病毒系统建立Nestin基因敲除的小鼠肾足细胞系

王璐萍 陶颖莉 黄平⋆

目的 基于CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除Nestin基因的条件永生性小鼠肾足细胞株（mouse podocyte，MP）。方法 利用Cas9过表达慢病毒构建条件性永生小鼠足细胞Cas9过表达稳转细胞系（CAS9/MP）。设计Nestin基因的3个位点（KO1、KO2、KO3），并构建3对靶向Nestin基因的sgRNA寡核苷酸序列，将其连接进GV371质粒中，测序验证后，包装慢病毒颗粒，感染构建好的CAS9/ MP，嘌呤霉素筛选（Puromycin）阳性克隆细胞，Cruiser TM酶切检测CAS9-sgRNA对目的基因的剪切活性。结果 成功构建了CAS9/MP及GV371-Nes-sgRNA重组载体，CruiserTM酶法验证表明，CAS9-sgRNA2具有剪切活性。结论 建立能稳定敲除Nestin基因的CRISPR/Cas9 慢病毒系统，成功获得Nestin敲除的MP稳转细胞株。为进一步研究Nestin在足细胞中的作用机制奠定基础。

CRISPR/Cas9 Nestin基因敲除 小鼠肾足细胞

足细胞附着于肾小球基底膜（GBM）的外侧，是一种具有复杂细胞骨架系统的高度分化的上皮细胞，是肾小球滤过屏障的有效组成部分［1］。足细胞损伤参与多种肾脏疾病的发生、发展［2-4］。巢蛋白（Nestin）作为第Ⅵ类中间丝细胞骨架蛋白，主要表达于足细胞胞浆及初级足突，对维持足细胞的形态和功能具有重要作用［5］。抑制Nestin可明显减少足细胞足突数量［6］。研究表明，细胞骨架蛋白的改变参与了足细胞的损伤过程［7-8］。2015年7月至2016年1月作者应用CASCRISPR/Cas9慢病毒系统构建稳定沉默Nestin基因的条件永生性小鼠肾足细胞株，为深入研究Nestin基因在糖尿病肾脏病足细胞中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料及试剂 （1）细胞株和慢病毒载体：条件性永生小鼠足细胞（mouse podocyte）购自中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院基础医学细胞中心（3111C0001CCC000230），CAS9蛋白慢病毒质粒（LV-Cas9-Puro）、GV371载体（LV-sgRNA-EGFR）、293T细胞、DH5a细胞购自上海吉盛医学科技有限公司。（2）实验试剂：1640培养基及胎牛血清、胰酶购于四季青公司。Polybrene助感染试剂、Enhanced Infection Solution感染增强剂、慢病毒包装试剂盒。DNA Marker 、逆转录及荧光定量PCR试剂盒（TaKaRa）。T4 DNA连接酶、Bbs I购自New England Biolabs（NEB）公司，质粒抽提试剂盒购自Qiagen 公司，Lipofectamine® 2000 试剂购自Invitrogen公司。本实验Nestin靶点的设计、寡核苷酸序列、所有引物由上海吉凯基因设计合成。

1.2 方法 （1）CAS9过表达稳转细胞株的构建：在细胞转染前一天，将处于对数生长期的小鼠肾足细胞胰酶消化，完全培养基制成（3～5）×104个/ml细胞悬液接种于6孔板中，接种体积2ml/孔，感染时细胞密度20%/孔，分为CON组和OE组，感染条件为Eni.S，MOI为15。感染当天OE组加入Lenti-CAS9慢病毒颗粒15μl进行目的细胞感染实验。感染3d后进行Puromycine筛选，Puromycin维持浓度2.00μg/ml。qPCR法检测两组LV-Cas9-Puro表达丰度，内参基因GAPDH：上游引物序列TGGTGAAGGTCGGTGTGAAC，下游引物序列GCTCCTGGAAGATGGTGATGG，扩增片段为231bp；目的基因LV-Cas9-Puro：上游引物序列GCTGAAAACCTATGCCCACC，下游引物序列GATTGTCTTGCCGGACTGCT，扩增片段为133bp。（2）

表1 靶向Nestin 基因的sgRNA寡核苷酸链合成序列

表2 慢病毒感染293T细胞48h培养液病毒颗粒滴度

2 结果

2.1 构建CAS9小鼠肾足细胞稳定株 当CON组和OE组细胞密度为80%时，Trizol法提取两组细胞总RNA，反转录成cDNA后qPCR法检测结果显示，OE组LV-Cas9-Puro表达丰度是CON组的9731.012 倍（P＜0.05）（见图1），成功构建CAS9小鼠肾足细胞稳定株。

图1 CON组和OE组LV-CAS9的表达丰度（P＜0．05）

图2 靶向Nestin基因的Nes-sg RNA的载体测序结果

2.2 重组质粒载体的检测 重组质粒载体LV-NessgRNA1 、LV-Nes-sgRNA2和LV-Nes-sgRNA3的测序重组质粒基因测序结果显示，在酶切位点之间插入的片段位置、方向及序列与sgRNA一致，重组质粒构建成功（见图2）。合成sgRNA寡核苷酸链并构建载体：根据sgRNA设计原则设计3对靶向Nestin基因的sgRNA，在正义链模板的5′端添加CACC；反义链模板的5′端添加AAAC同时C'端添加C。合成后的寡核苷酸单链先通过退火形成双链，连接至Bbs I 酶切线性化的GV371质粒中（GV371-sgRNA1、GV371-sgRNA2、和GV371-sgRNA3），转化到感受态细胞大肠杆菌菌株DH5a，用去内毒素质粒小提试剂盒提取质粒，并测序验证。见表1。（3）Lv-Nes-sgRNA慢病毒颗粒的包装：将重组病毒质粒LV-Nes-sgRNA1、LV-NessgRNA2和LV-Nes-sgRNA3及包装质粒混合物Lenti-Easy Packaging Mix分别进行高纯度无内毒素抽提，按Invitrogen公司Lipofectamine 2000使用说明进行共转染293T细胞，培养48h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，浓缩纯化后用荧光法测定病毒滴度。见表2。（4）细胞培养和细胞转染：用包装好的Lv-NessgRNA慢病毒颗粒去感染CAS9小鼠肾足细胞稳转株。CAS9/MP用含10%胎牛血清的1640培养基于5%CO2，37℃恒温培养。转染前24h，取对数期细胞以（3～5）×104/ml接种到12孔板培养，转染16h后换液，转染72h后进行Puromycine筛选，Puromycin维持浓度1.00μg/ml。将其分为：NC组（阴性对照组）、PC组（阳性对照组）、KO1组（LV-Nes-sgRNA1组）、KO2组（LV-Nes-sgRNA2组）和KO3组（LV-Nes-sgRNA3组）（5）CruiserTM检测CAS9-sgRNA的剪切活性：设计包含sgRNA目标序列的Nestin基因片段的PCR扩增引物（上游引物：TCAGAGGGGTCTGAGTCTGCT，下游引物：AGGCTGAGATGATGAGAGTCAC）。CAS9过表达小鼠肾足细胞感染慢病毒后，收集细胞，抽提细胞混合克隆基因组。PCR扩增退火（上、下游引物：各1μl，2×Taq Plus Master Mix：25μl，Genomic DNA：2μl，ddH2O 22μl），获得杂交DNA产物，自然冷却至＜40℃，加入CruiserTM酶切15～20min，酶切PCR反应体系（PCR产物：2～3μl，Detecase Buffer：2μl，Detecase：1μl，Add ddH2O to 10μl），45℃反应20min后立即向上述10μl体系内加入2μl Stop Buffer，随后将全部样品进行2%琼脂糖凝胶电泳检测。

2.3 Nestin靶向序列的筛选 将阴性对照病毒、LVNes-sgRNA1、LV-Nes-sgRNA2和LV-Nes-sgRNA3分别瞬时转染至CAS9小鼠肾足细胞稳定株，72h后，转染了LV-Nes-sgRNA的CAS9/MP细胞多数表达绿色荧光，表明质粒转染CAS9/MP细胞成功（见图3）。7d后提取基因组DNA进行PCR扩增，结果显示PCR检测到目的大小条带且KO2靶点检测出活性（见图4）。

图3 LV-Nes-sgRNA感染CAS9/MP细胞

图4 CruiserTM 筛选活性sgRNA

3 讨论

基因组编辑技术为了解特定基因的功能提供基础，传统基因敲除以ZFN及TALEN技术的应用较为广泛，但其操作时间长，对实验要求高，筛选工作量大，易出错成为其发展的瓶颈［9］。规律成簇间隔短回文重复序列及其相关系统（CRISPR/Cas system）存在于大约50%的细菌和90%的古细菌基因组中［10-11］，是抵御外来噬菌体、质粒或其他移动元件侵染的获得性免疫系统［12-14］。CRISPR/CAS系统依赖于CAS和crRNA形成的蛋白核酸复合物对DNA序列上PAM（protospacer adjacent motif）区域的识别，利用这一特性对基因组特定位点进行基因组编辑［15］。CRISPR/Cas9系统具有简单灵活、特异性高、细胞毒性低等特点，可以对特定基因组位点进行切割置换［16］。目前已有研究基于CRISPR/Cas9技术成功实现了对动物、细胞、植物单基因、双基因及多基因的敲除［17］。本研究构建Nestin基因敲除的MP稳转细胞株，是深入研究Nestin基因功能及其在糖尿病肾脏病中的作用机制的基础。

［1］ Haraldsson B,Nystrom J,Deen WM．Properties of the glomerular barrier and mechanisms of proteinuria．Physiol Rev,2008,88(2):451．

［2］ Sasaki H,Kimura J,Nagasaki K,et al．Sasaki N5．Mouse chromosome 2 harbors genetic determinants of resistance to podocyte injury and renal tubulointerstitial fibrosis．BMC Genet,2016,17(1):69．

［3］ Koga K,Yokoi H,Mori K,et al．Mukoyama M．MicroRNA-26a inhibits TGF-β-induced extracellular matrix protein expression in podocytes by targeting CTGF and is downregulated in diabetic nephropathy．Diabetologia,2015,58(9):2169-2180．

［4］ Tae-Sun Ha．High-glucose and advanced glycosylation end products increased podocyte permeability via PI3-K/Akt signaling．Journal of Molecular Medicine,2010,88:391-400．

［5］ Su W,Fang C,Yang HC,et al．Expression of nestin in human kidney and its clinical significance．Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi, 2008,37(5):309-312．

［6］ Su W,Chen J,Yang H,et al．Expression of Nestin in the podocytes of normal and diseased human kidneys．Chinese Journal of Pathology, 2007,22(5):1761-1767．

［7］ 刘巍,段惠军,张悦,等．中间丝蛋白Nestin在不同病程糖尿病大鼠肾组织中的表达．中国组织化学与细胞化学杂志,2011, 4:301-305．

［8］ Xifeng Sun,Yongli Chu,Chun Zhang,et al．Effect of TRPC6 knockdown on puromycin aminonucleoside-induced podocyte injury．Journal of Huazhong University of Science and Technology-Medical Sciences,2012,32(3):340-345．

［9］ Thomas G,Charles A,Carlos F．ZFN,TALEN,and CRISPR/Cas based methods for genome engineering．Trends Biotechnol,2013, 31(7): 397-405．

［10］ Cédric Noraisa, Annick Moisanb, Christine Gaspinb, et al．Diversity of CRISPR systems in the euryarchaeal Pyrococcales．RNA Biology, 2013,10(5):659-670．

［11］ Lillestol R,Redder P,Garrett RA．A putative viral defence mechanism in archaeal cells．Archaea,2006,2(1):59-72．

［12］ Grissa I,Vergnaud G,Pourcel C．The CRISPRdb database and tools to display CRISPRs and to generate dictionaries of spacers and repeats．BMC Bioinformatics,2007,8(1):172．

［13］ Luhan Yang, Prashant Mali, Caroline Kim-Kiselak, George Church．CRISPR-Cas-Mediated Targeted Genome Editing in Human Cells, 2014．

［14］ Makarova KS,Aravind L,Wolf YI, et al．Unification of Cas protein families and a simple scenario for the origin and evolution of CRISPR-Cas systems．Biology Direct,2011,6(1):38．

［15］ Hwang WY,Fu Y,Reyon D,et al．Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system．Nature Biotechnology, 2013, 31(3):227-229．

［16］ Fu Y, Foden JA, Khayter C, et al． High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells．Nature Biotechnology,2013,31(9):822-826．

［17］ Hai T,Teng F,Guo R,et al． One-step generation of knockout pigs by zygote injection of CRISPR/Cas system．Cell Res, 2014, 24:372-375．

Objective To establish mouse podocytes Nestin gene knockout cell lines stably based on CRISPR/Cas9 system. Methods Using Cas9 overexpression of lentivirus to build Cas9 overexpression of conditional permanent resident mouse podocytes cell lines.Three gene loci of Nestin（KO1、KO2、KO3）and three pairs of sgRNAs targeting Nestin were designed and inserted in GV371 vector to construct GV371-Nes-sgRNA expression vector for knockout.After sequenced and packed lentivirus particles，then used them to transfect the built CAS9 overexpress MPC.Then puromycin was used to screen positive cells.The enzyme of Cruiser TM to verify CAS9- sgRNA' shear of targeting gene activity. Results Cas9/MP and recombinant plasmid of GV371-Nes-sgRNA was constructed successfully.Cruiser TM verified that the knockout activity of CAS9-sgRNA2 was the maximum. Conclusion The stable MP cell lines of Nestin-knockout are successfully generated by CRISPR/Cas9 system，which provides the foundation for further studying the functions of Nestin gene.

CRISPR/Cas9 Nestin gene knockout Mouse podocyte

浙江省自然科学基金（LY13H290016）

310053 浙江中医药大学第一临床医学院

310006 浙江省中医院

*通信作者