实验性NOD小鼠慢性淋巴细胞性甲状腺炎造模建立及其机制研究

叶志鹏 吴可人 方蓉 李宁 徐涛 金法

实验性NOD小鼠慢性淋巴细胞性甲状腺炎造模建立及其机制研究

叶志鹏 吴可人 方蓉 李宁 徐涛 金法

目的 探讨NOD小鼠慢性淋巴细胞性甲状腺炎（CLT）建模方法及其机制研究。方法 NOD小鼠20只，随机分为2组，对照组予每天饮用蒸馏水，而造模组饮用0.05%碘水（0.64g NaI/L），持续8周后取甲状腺组织及血浆，观察两组小鼠甲状腺体组织病理改变和血浆抗小鼠TG抗体水平变化；ELISA测定小鼠脾脏中IL-4或IFN-γ，分析碘剂对CLT小鼠Th1/Th2细胞比值的影响。结果 （1）与对照组比较，造模组炎性细胞浸润程度较大，且差异有统计学意义（P＜0.05）。（2）血浆中血浆抗小鼠 TG抗体OD值，造模阻比对照组有明显升高（P＜0.05）。（3）与对照组比较，造模组中IL-4明显下降（P＜0.05），IFN-γ明显升高（P＜0.01），IFN-γ/IL-4比值升高（P＜0.05）。结论 碘剂诱导小鼠慢性淋巴细胞性甲状腺炎造模建立是可行的。过量碘剂能通过促进IFN -γ等Th1细胞因子分泌，抑制IL -4等Th2细胞因子分泌，使Th1 /Th2 细胞平衡向 Th1 方向偏离，形成免疫性甲状腺炎。

桥本甲状腺炎 碘剂 造模 Th细胞

慢性淋巴细胞性甲状腺炎（CLT）以甲状腺内单核细胞浸润、甲状腺球蛋白（TG）和甲状腺多氧化物酶抗体的生成为主要特征，受遗传和环境等多种因素影响［1-2］，其确切发病机制尚不明确。碘作为自身免疫性甲状腺疾病（AITD）发病的重要环境因子，其作用环节和机制尚未明确，动物试验表明当增加碘的摄入时，动物甲状腺内淋巴及单核细胞浸润程度也逐渐加重［3］。2014年8月至2017年8月作者采用碘摄入建立实验性小鼠慢性淋巴细胞性甲状腺炎模型，同时为高碘食物致小鼠桥本甲状腺炎的防治提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 6～8周龄NOD小鼠20只（购于北京康生物有限公司），体质量18～22g，雌雄不限。小鼠称其体重，按随机数字表法分为2组，分别为对照组和造模组，每组各10只（造模组在实验过程中死亡1只，实际数目为9只）。

1.2治疗方法:对照组患者给予吸氧、保持呼吸道通畅,抗感染,平喘,祛痰,适当强心,利尿,纠正水、盐、电解质及酸碱平衡紊乱等综合治疗。观察组在对照组基础上,另外给予低分子肝素钙4000U皮下注射,2次/d,再给予前列地尔10μg静脉注射,1次/d,总疗程10d。

1.2 试剂与仪器 低速离心机购于美国Beckman公司；Olympus显微镜（BX51+FL，Olympus，Japan）包埋机（Leica EG1150H）；LKBV型超薄切片机（瑞典LKB公司）；ELX800TM 酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）；小鼠抗甲状腺球蛋白抗体（ATGA/TGAB）酶联免疫吸附测定试剂盒购于上海西唐公司；小鼠白介素-4（IL-4）及小鼠γ干扰素（IFN-γ）酶联免疫检测试剂盒购于上海西唐公司。

1.3 方法 （1）动物模型建立：两组NOD小鼠相同的食料饲养，环境温度为18～22℃，相对湿度为50%～60%。对照组予每天饮用蒸馏水，而造模组饮用0.05%碘水（0.64gNaI/L），持续8周［4］。（2）标本采集：8周后小鼠乙醚麻醉，眶静脉取血，室温静置6h，3000r/min离心20min，分离血清并冷藏标本。颈部正中切口，分离皮肤及肌肉层，暴露器官，显露甲状腺软骨侧后方的两叶甲状腺。将气管和甲状腺一并取下，迅速剥离甲状腺，冷生理盐水冲洗，滤纸吸干，并放置4%甲醛溶液中固定。同时，腹部正中切口，分离皮肤及肌肉，暴露脾脏，离断脾血管及韧带，冷生理盐水冲洗，滤纸吸干，并1～4℃温度下冷藏标本。（3）甲状腺病理学观察：小鼠甲状腺组织4%甲醛溶液固定，石蜡包埋，切成4μm切片，苏木素-伊红（HE）染色。按单核细胞浸润程度分级：0级：正常甲状腺组织；Ⅰ级：＜1%的甲状腺有淋巴细胞浸润；Ⅱ级：1%～10%淋巴细胞浸润；Ⅲ级：10%～40%淋巴细胞浸润；Ⅳ级：＞40%淋巴细胞浸润。（4）IFN-γ和IL-4细胞因子测定：在各孔加入标准品或样品各100μl，37℃孵育90min；加入100μl生物化抗体工作液，37℃孵育60min；洗涤3次；加入100μl酶结合物工作液，37℃孵育30min；洗涤5次；加入90 μl底物溶液，37℃孵育15min左右；加入50μl终止液，立即在450nm波长测量OD值并计算结果。（5）血浆抗小鼠TG抗体水平测定：采用小鼠抗甲状腺球蛋白抗体（ATGA/TGAB）酶联免疫吸附测定试剂盒双抗体夹心法测定：在各孔加入标准品或样品各100μl，37℃孵育90min；加入100μl生物化抗体工作液，37℃孵育60min；洗涤3次；加入100μl酶结合物工作液，37℃孵育30min；洗涤5次；加入90μl底物溶液，37℃孵育15min左右；加入50μl终止液，立即在450nm波长测量OD值并计算结果。

2.3 TgAb各组间比较 8周后，血浆抗小鼠TG抗体OD值，造模组比对照组明显升高（P＜0.001）。

2 结果

2.1 甲状腺病理分级比较 显微镜下可见对照组甲状腺滤泡大小不一，较为均匀一致，滤泡上皮细胞为单层立方形或高柱形。造模组滤泡结构紊乱，上皮细胞挤压变扁，间质减少，炎性细胞浸润明显，见图1、2。根据甲状腺炎的诊断标准：甲状腺腺体中炎性细胞的浸润程度＞2%。根据炎性浸润程度进行病理分级，造模组与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

本项目污水处理厂服务区域面积为23.4平方公里，工程规划设计规模为10万m3/d，其中一期已建规模4.8万m3/d，尾水排放标准按照 《城镇污水处理厂污染物排放标准》（GB18918-2002）二级标准执行。工程占地面积120.6亩，于2007年开始动工建设，目前该厂正式投入运行。

2.2 IL-4、IFN-γ、IFN-γ/IL-4各指标组间比较 与对照组比较，造模组中IL-4明显下降（P＜0.05），IFN-γ明显升高（P＜0.01），IFN-γ/IL-4比值升高（P＜0.05）。见表2。

表1 甲状腺病理分级比较

图1 对照组甲状腺病理检查镜下显示

图2 造模组甲状腺病理检查镜下显示

槭树科(Aceraceae)植物泛称“槭树”或“枫树”。槭树科植物树叶可呈现出绿色、紫色、红色、金黄色的亮丽色彩且季相变化明显，是世界著名的色叶观赏树种。河南槭树科植物资源丰富，且具有南北交融、东西过渡的特征[1]。笔者以郑州地区适宜生长槭树科植物为例，探讨其在植物景观中的配置模式，以充分挖掘利用河南地区槭树科植物资源，进而为槭树科植物在园林景观中应用提供参考依据。

表2 IL-4、IFN-γ、IFN-γ/IL-4各指标的组间比较（x±s）

1.4 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件。正态分布计量资料用（x±s）表示，用配对t检验，偏态分布计量资料以中位数表示，用秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

表3 TgAb各组间比较（x±s）

3 讨论

桥本甲状腺炎（HT）以甲状腺内单核细胞浸润、甲状腺球蛋白（TG）和甲状腺多氧化物酶抗体的生成为主要特征，受遗传和环境等多种因素影响［5］，其确切发病机制尚不明确。碘通常以无机碘的形成在胃肠中被吸收，同时其作为T3、T4合成必需成分。然而，碘也是引起甲状腺疾病的重要环境因素［6］。本实验通过碘剂造模，造模组甲状腺病理切片光镜下显示滤泡结构紊乱，上皮细胞挤压变扁，间质减少，炎性细胞浸润明显，这些均为HT的主要特征表现，且较对照组明显增多（P＜0.001），TGAb滴度值较对照组上升明显（P＜0.001），表明过量碘剂NOD小鼠桥本甲状腺炎造模的可行性。

Th1和Th2细胞所诱导的免疫反应能交互调节，一旦这种平衡被打破，则出现以 Th1或Th2型优势反应，引起异常免疫应答，造成病理状态，将导致疾病发生［7］。在本资料中，与对照组比较，造模组IL-4下降，IFN-γ升高，IFN-γ/IL-4值升高，且均有统计学意义（P＜0.01）。用Th1细胞因子IFN-γ和Th2 细胞因子IL-4反映Th1/Th2细胞免疫应答强度的指标，则造模组较对照组Th1 /Th2 细胞平衡向Th1方向偏离。与较多学者［8］认为HT是Th1型优势的免疫反应的观点一致，也证明碘剂NOD小鼠桥本甲状腺炎造模成功。

综上，过量碘剂对于NOD小鼠桥本甲状腺炎造模是可行的。过量碘剂能通过促进IFN -γ等Th1细胞因子分泌，抑制IL -4等Th2细胞因子分泌，使Th1 /Th2 细胞平衡向 Th1 方向偏离，形成免疫性甲状腺炎。

［1］ Jacobson EM,Huber A,Tomer Y．The HLA gene complex in thyroid autoimmunity:from epidemiology to etiology．J Autoimmun, 2008, 30(1/2):58-62．

［2］ LiM,Boyages SC．Iodide induced lymphocytic thyroiditis in the BB/W rat:evidence of direct toxic effects of iodide on thyroid subcellular structure． Autoimmunity,1994,18(1):31-40．

［3］ Shoenfeld Y,Zandman -Goddard G,Stojanovich L,et al．The mosaic of autoimmunity:hormonal and environmental factors invdved in autoimmune diseases-2008．Isr Med Assoc J,2008,10(1):8-12．

［4］ Pramyothin P,Leung AM,Pearce EN,et．al． Clinical problemsolving． A hidden solution．N Engl J Med,2011,365:(22):2123-2127．

［5］ 陈雪梅,刘燚, 范源,等．碘过量与桥本氏甲状腺炎的关系研究进展．昆明医科大学学报,2014,35(12):169-174．

［6］ Weetman AP．Cellular immune responses in autoimmune thyroid diseases．Clin Endocrinol(oxf),2004,61(4):405-413．

［7］ Phenekos C, Vryonidou A, Gritzapis AD, et al． Th1 and Th2 serum cytokine profiles characterize patients with Hashimoto's thyroiditis (Th1)and Graves disease (Th2)． Neuroimmunomodulation, 2004, 11(4):209-213．

［8］ 于秀杰,李庆欣,刘凤华,等．碘过量和甲状腺腺球蛋白免疫诱发NOD小鼠甲状腺炎的病变特征．中华内分泌代谢杂志,2009,25(3),269-273．

Objective To investigate mechanism research and modeling method of Hashimoto’s Thyroiditis of experimental NOD mice. Method 20 NOD mice were divided equally into model group and normal group，and were separately fed with diet of iodine（0.64g NaI/L）and distilled water.Eight weeks later，thyroid tissue and plasma were collected to observe the histopathological changes of thyroid gland and the level of anti TG antibody in plasma. IFN-γ and interleukin-4（IL-4）produced by splenocytes were measured by enzyme-linked immunosorbent assay. Result （1）Compared with control group by histopathology detection，NOD mice developed CLT in normal group was less than that of the model group，which was obviously different（P＜0.05）. （2）There was a difference in serum mTgAb among the both groups，and had statistical significance.（P＜0.05）.（3）In the model groups，the IL-4 was lower，IFN-γ and IFN-γ/IL-4 were higher than that of the normal group. Conclusion It is feasible to establish a model of chronic lymphocytic thyroiditis induced by iodine in mice. Adequate iodine can promote the secretion of Th1 cytokine including IFN-γ and suppress Th2 cytokine including IL-4，which results in the disorder of Th1/Th2，and even Th1 cells take a more important role.

Hashimoto’s Thyroiditis Iodine Modeling Th cell

浙江省中医药科技计划项目（2A11414）

310006 浙江中医药大学附属第一医院