p38MAPK特异性抑制剂SB203580对糖尿病小鼠肾小球滤过率的影响

赵咏莉 姚新明⋆ 陈月平 何春玲 翟清 王勇

p38MAPK特异性抑制剂SB203580对糖尿病小鼠肾小球滤过率的影响

赵咏莉 姚新明⋆ 陈月平 何春玲 翟清 王勇

目的 探讨p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）特异性抑制剂SB203580对糖尿病小鼠肾小球滤过率的影响及机制。方法 60只清洁级小鼠随机分为正常对照组（NG组）、糖尿病组（DM组）和SB203580治疗组（SB组）。测定小鼠血清超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量、尿白蛋白排泄和肾小球滤过率。结果 与NG组比较，DM组血清SOD活性明显降低，MDA含量和尿白蛋白排泄明显增加（P＜0.05）；与DM组比较，SB组血清SOD活性升高，MDA含量和尿白蛋白排泄降低（P＜0.05）。与NG组比较，DM组肾小球滤过率降低（P＜0.05）；与DM组比较，SB组肾小球滤过率升高（P＜0.05）。相关性分析：肾小球滤过率与血清SOD活性存在正相关关系（r=0.670，P＜0.001），与血清MDA含量存在负相关关系（r=-0.731，P＜0.001）。结论 p38MAPK特异性抑制剂SB203580通过减轻氧化应激改善肾小球滤过率。

p38MAPK 氧化应激 糖尿病小鼠 肾小球滤过率

糖尿病肾脏疾病（DKD）是糖尿病的主要微血管并发症，也是引起终末期肾病的主要原因之一。p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）是MAPKs 家族的重要成员，对于调节细胞代谢、分化、增殖及凋亡等具有重要作用。同时p38MAPK信号通路是糖尿病肾脏疾病的发病机制中较多信号转导通道的交点，参与糖尿病肾脏细胞外基质重构及肾脏进行性纤维化［1］。2016年7月至2017年2月作者通过观察SB203580（p38MAPK特异性抑制）抑制p38MAPK信号通路对糖尿病小鼠肾小球滤过率的影响，探讨p38MAPK信号通路在糖尿病肾脏疾病中的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级小鼠60只，体质量18～22g，试验使用小鼠购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。1.2 主要药物及试剂 SB203580（sigma公司），STZ（sigma公司），SOD、MDA测试盒（南京建成生物工程研究所），菊粉测试盒（Cayman公司），尿肌酐测定测试盒及尿微量白蛋白测定试剂盒（中国利德曼生化股份有限公司）。

1.3 仪器 德国罗氏血糖仪、Elx800通用型酶联免疫检测仪（美国BioTek公司）、UV754N型紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）、ADVIA Centaur 全自动化学发光免疫分析仪（德国西门子公司）。

1.4 方法 （1）动物模型的制备及分组：60只清洁级小鼠适应性饲养1周，随机分为3组：正常对照组（NG组）、糖尿病组（DM组）和SB203580治疗组（SB组），每组各20只。正常对照组：正常小鼠。糖尿病组：小鼠高脂饮食4周，腹腔均注射链脲佐菌素STZ［0.1mol/ L无菌枸橼酸缓冲液配制为6.5mg/ml（pH4.3）］，每次40mg/kg，连续5d，48h后采空腹尾外周血测血糖，以德国罗氏血糖仪测血糖≥16.7mmol/L，入选糖尿病小鼠模型。SB203580治疗组：糖尿病小鼠予以1次/d腹腔注射SB203580，5mg/（kg·d），共5次。（2）造模成功后4周行股静脉插管输入菊粉，膀胱切开插入导尿管测定肾小球滤过率，并收集血液及尿液。

1.5 实验室检测（1）ELISA法检测血清超氧化物歧

2 结果

2.1 一般状态 正常对照组小鼠的一般状况良好，DM组小鼠出现多饮，多食，多尿，体重减轻，精神萎靡等表现，SB组小鼠在实验过程中，上述症状均较DM组轻，且体重有增加。

2.2 三组各项观察指标比较 与 NG组比较，DM组血液SOD活性明显降低，MDA含量和尿白蛋白排泄明显增加（P＜0.05）；与DM组比较，SB组血液SOD活性明显升高，而MDA含量和尿白蛋白排泄明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。与NG组比较，DM组肾小球滤过率降低（P＜0.05）；与DM组比较，SB组肾小球滤过率升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 三组各观察指标比较（x±s）

图1 肾小球滤过率与血清SOD活性

图2 肾小球滤过率与血清MDA含量

2.3 相关性分析 Pearson 相关分析结果显示，肾小球滤过率与血清SOD活性间存在正相关关系（r=0.670， P＜0.001），见图1。肾小球滤过率与血清MDA含量之间存在负相关关系（r=-0.731，P＜0.001），见图2。化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量：采用双抗体夹心-ELISA法。用抗小鼠SOD/MDA单抗（一抗）包被于酶标板上，标准品和样品中的小鼠SOD/MDA与单抗结合；加入生物素化的抗小鼠SOD/MDA（二抗），形成免疫复合物连接在板上。辣根过氧化物酶标记的抗生物素蛋白链球菌（Streptavidin）与二抗的生物素结合，加入酶底物TMB，出现蓝色；加终止液硫酸，颜色变黄；在450nm处测定OD值，根据标准曲线可得出小鼠SOD活性和MDA含量。（2）免疫比浊法检测尿白蛋白：免疫比浊法检测尿白蛋白，尿白蛋白与试剂中抗小鼠白蛋白抗体在缓冲液中形成抗原抗体复合物，可使反应液出现浊度。与校正品对照，即可得出未知白蛋白的含量。（3）肌氨酸氧化酶法检测尿肌酐：尿液中的肌酐在肌酐酶作用下水解生成肌酸，肌酸在肌酸酶作用下生成肌氨酸和尿素，肌氨酸在肌氨酸氧化酶作用下生成甘氨酸、甲醛、过氧化氢，在过氧化物酶作用下生成蓝色染料，600nm波长有特异吸收峰，吸光度的升高与肌酐浓度成正比。（4）肾小球滤过率测定：荧光法检测血液、尿液菊粉浓度，在激发光波长540nm，吸收光波长590nm处检测OD值，根据标准曲线得出标本中菊粉的含量。肾小球滤过率=尿菊粉浓度（mg/ml）×尿量（ml/min）/血菊粉浓度（mg/ml）。

1.6 统计学方法 采用 SPSS22.0 统计软件。计量数据以（x±s）表示，采用单因素方差分析，变量间相关分析采用直线相关，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 讨论

DKD是以肾小球系膜细胞增殖、肥大及细胞外基质过度积聚为特点的肾脏病变。近年来研究显示，氧化应激在DKD的发生发展中起重要作用。在高糖状态下，清除氧自由基的各种抗氧化酶的活性被抑制，引起氧自由基增多，进而损伤肾脏组织。有研究报道高血糖导致线粒体呼吸链复合物受损，产生过量肾皮质总活性氧（ROS），激活一系列信号分子，介导多种炎性因子、趋化因子释放并作用于肾脏细胞，导致细胞及组织损伤，发生糖尿病肾脏疾病［2］。SOD是机体内源性最主要的氧自由基清除剂，能保护细胞免受损伤，MDA是氧自由基引起的脂质过氧化物的降解终产物，可破坏细胞结构和功能，间接反映细胞的受损程度及自由基的含量。通过测定SOD活性和MDA含量可以反映出机体的氧化应激状态，本资料结果显示与 NG组比较，DM组血清SOD活性明显降低，MDA含量明显增加，尿白蛋白排泄升高，肾小球滤过率下降（P＜0.05）。Pearson 相关分析结果显示，肾小球滤过率与血清SOD活性之间存在正相关关系（r=0.670，P＜0.001）；与血清MDA含量之间存在负相关关系（r=-0.731，P＜0.001），表明高血糖加剧氧化应激状态，氧化应激加强后进而降低肾小球滤过率并促进尿白蛋白排泄。

p38MAPK信号通路参与细胞增殖、分化及转化过程，可引起肾小球系膜细胞外基质积聚和肾小球硬化，有研究显示p38MAPK信号通路与DKD密切相关［3］。p38MAPK信号通路的激活可导致肾小球硬化，而抑制p38MAPK信号通路的激活，可改善DKD的炎症性损伤［4］。SB203580可能通过下调p38MAPK 表达，抑制近端肾小管上皮细胞增殖及胞浆中α-平滑肌肌动蛋白的表达，从而延缓肾脏纤维化进程［5］。本资料结果显示与 NG组比较，DM组肾小球滤过率降低，尿白蛋白排泄升高，SB203580治疗后，肾小球滤过率升高，尿白蛋白排泄降低（P＜0.05），提示抑制p38 MAPK信号通路可改善肾小球滤过率并延缓DKD的发展。

P38MAPK信号通路与氧化应激密切相关，文献报道高糖刺激能使体外培养的系膜细胞 p38MAPK 信号通路激活，氧化应激增强［6］。Song等揭示p38MAPK抑制剂SB203580能降低脊髓损伤大鼠体内MDA含量，并提高SOD活性［7］，本资料结果显示予以SB203580治疗后，血清SOD活性明显升高，而MDA含量明显降低，与DM组比较差异有统计学意义（P＜0.05），进一步提示p38 MAPK信号通路的激活可以增强氧化应激，促进DKD的发展，而特异性抑制p38MAPK信号通路后可有效改善氧化应激状态。

总之，DKD的发病机制复杂，临床尚缺乏有效的治疗手段。本资料结果提示SB203580特异性抑制p38MAPK信号通路，可减轻氧化应激并改善肾小球滤过率，具有肾脏保护作用。因此，p38MAPK在DKD中的作用有待进一步深入研究，其有可能成为治疗DKD的新靶点。

［1］ Li X,Liu W,Wang Q,et al．Emodin suppresses cell proliferation and fibronectin expression via p38MAPK pathway in rat mesangial cells cultured under high glucose．Mol Cell Endocrinol,2009,307(1):157 -162．

［2］ Lee HY, Park SH, Lee M, et al． 1-Dehydro-10 gingerdione from ginger inhibits IKKβ activity for NF-κB activation and suppresses NF-κB-regulated expression of inflammatory genes．Br J Pharmacol, 2012,167(1):128-140．

［3］ 张苏皖,李素梅．P38丝裂原活化蛋白激酶在炎症因子诱导糖尿病肾病中的作用．国际病理科学与临床杂志,2011,31(1):73-77．

［4］ Zhang YJ, Tian ZL, Yu XY,et al．Activation of integrin β1-focal adhesion kinase-RasGTP pathway plays a critical role in TGF beta1-induced podocyte injury．Cell Signal, 2013,25(12):2769-2779．

［5］ 贾林,林智峰,马莉,等．P38MAPK 抑制剂 SB203580 对高糖诱导HK-2 细胞转分化的影响．天津医药,2016,44(4):426-429．

［6］ 贾会玉,李中南,陈光亮．转化生长因子-β1介导的Smads和MAPKs信号通路在糖尿病肾病中的作用及其抑制剂研究进展．中国临床药理学与治疗学,2015,20(10):1171-1176．

［7］ Song Y, Liu J, Zhang F, et al． Antioxidant effect of quercetin against acute spinal cord injury in rats and its correlation with the p38MAPK/iNOS signaling pathway． Life Sci, 2013, 92(24-26): 1215-1221．

Objective To observe the effect of p38 mitogen-activated protein kinase（p38MAPK）specific inhibitor SB203580 on glomerular filtration rate in diabetic mice. Methods Sixty clean mice were randomly divided into normal control group（NG group），diabetic group（DM group）and SB203580 treatment group（SB group）. The activity of superoxide dismutase（SOD），content of malondialdehyde（MDA），urinary albumin excretion and glomerular filtration rate were measured. Results （1）Compared with NG group，the activity of SOD in DM group was significantly decreased，the content of MDA and urinary albumin excretion were significantly increased（P＜0.05）. Compared with DM group，the activity of SOD in SB group was increased，the content of MDA and urinary albumin excretion were decreased（P＜0.05）.（2）The glomerular filtration rate of DM group was lower than that of NG group（P＜0.05），and the glomerular filtration rate of SB group was higher than that of DM group（P＜0.05）.（3）Correlation analysis：The glomerular filtration rate was positively correlated with the activity of SOD（r=0.67，P＜0.001），and the glomerular filtration rate was negatively correlated with the content of MDA（r=-0.731，P＜0.001）. Conclusion p38MAPK specific inhibitor SB203580 improves glomerular filtration rate by reducing oxidative stress.

p38MAPK Oxidative stress Diabetic mice Glomerular filtration rate

安徽省自然科学基金资助项目（1608085QH191）；安徽省芜湖市皖南医学院校中青年科研基金（WK200938F）

241000 皖南医学院弋矶山医院

*通信作者