宫颈癌患者血清miR-130a的表达及意义*

沙敏，何翠琴，钱华，樊晓艳，王变，汪佳

(泰州市人民医院， a. 中心实验室，b. 妇产科，c. 新生儿重症监护室，d. 感染科，e. 生殖医学科，江苏泰州 225300)

·液体活检与临床实验研究·

宫颈癌患者血清miR-130a的表达及意义*

沙敏a，何翠琴b，钱华b，樊晓艳c，王变d，汪佳e

(泰州市人民医院， a. 中心实验室，b. 妇产科，c. 新生儿重症监护室，d. 感染科，e. 生殖医学科，江苏泰州 225300)

目的 分析宫颈癌患者血清miR-130a的表达水平及临床意义。方法 用荧光定量PCR检测60例宫颈癌患者和60例体检健康者血清miR-130a的表达水平，分析血清miR-130a水平与宫颈癌患者临床病理参数的相关性。结果 与体检健康者(0.029±0.024)相比，宫颈癌患者血清miR-130a表达水平(0.087±0.038)明显升高(P<0.01)。miR-130a的高水平与肿瘤分化(P<0.01)以及肿瘤分期(P=0.01)密切相关。ROC曲线分析结果显示，血清miR-130a诊断宫颈癌的曲线下面积(AUCROC)为0.878(95%CI:0.809～0.947)，敏感性为86.7%，特异性为90.8%。与早期宫颈癌患者(0.074±0.034)相比，晚期宫颈癌患者血清miR-130a表达水平(0.105±0.038)明显升高(P<0.05)；与术前(0.082±0.014)相比，宫颈癌术后血清miR-130a表达水平(0.033±0.022)明显降低(P<0.01)。结论 血清miR-130a有助于宫颈癌诊断和预后监测，并可作为宫颈癌进展的辅助判断指标。

宫颈癌；血清；miR-130a；预测指标

越来越多的研究证实，miRNA可作为宫颈癌早期诊断、术后监测及预后判断的生物学标志物[1-3]。研究发现，miR-130a在宫颈癌细胞中的表达异常升高，并可通过激活NF-κB等信号通路促进宫颈癌细胞增殖和侵袭转移[4]。此外，还有学者发现，宫颈癌组织中Dicer(miR-130a靶分子)的表达水平与宫颈癌远处转移和复发密切相关，其进一步的生存分析显示miR-130a高水平患者的无疾病生存(DFS)明显低于低水平患者[5]。本研究通过检测宫颈癌患者与体检健康者血清miR-130a表达水平的差异，旨在分析血清miR-130a作为宫颈癌诊断和预后监测指标的可能性。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2014年9月至2016年8月本院初诊的宫颈癌患者60例，年龄32～68岁,中位年龄50岁。均参照文献[6]，经病理组织学明确诊断，患者术前均未进行放化疗治疗。纳入标准：(1)初次治疗的患者；(2)无现在或既往的其他原发恶性肿瘤病史，临床记录完整；(3)有明确病理组织学诊断，均为宫颈癌。排除标准：(1)无卵巢癌、严重肝肾疾病、盆腔炎及其他严重脑部器质性病变；(2)排除生殖道结核、盆腔子宫内膜异位症、子宫内膜炎、有其他严重精神疾病者、消化道肿瘤及有酒精药物滥用史者；(3)不伴有心、肝、脑、肾、肺等器官及血液系统疾病。病理类型：鳞癌43例，腺癌17例；组织学分型：高分化和中分化28例，低分化32例；FIGO分期I～Ⅱ期35例， Ⅲ～Ⅳ期25例。随机选取15例术后1个月宫颈癌患者进行随访。收集同期体检健康女性60例作为健康人对照组，年龄30～65岁,中位年龄49岁。另收集同期就诊的38例慢性宫颈炎患者作为相关疾病对照，年龄30～67岁，中位年龄49.5岁。本研究经医院医学伦理学委员会批准，患者知情同意。

1.2 主要仪器及试剂 miRNeasy Mini Kit(德国Qiagen公司)；MicroRNA逆转录试剂盒(美国TaqMan公司)；HPV检测试剂盒(美国Digene公司)；微量高速离心机(德国Eppendorf公司)；实时荧光 PCR仪(7500型,美国ABI公司)。

1.3 HPV检测 采用第二代杂交捕获技术,按照HPV检测试剂盒说明书操作检测样本中HPV-DNA含量及结果判读。

1.4 血清miRNA的提取 Ⅰ～Ⅱ期宫颈癌患者于术前3～5 d抽取患者空腹静脉血3 mL，术后 5～7 d再次采集; Ⅲ～Ⅳ期宫颈癌患者于确诊时采集空腹静脉血3 mL; 健康人对照组于体检时采集空腹静脉血3 mL,1 500 r/min离心15 min，吸取血清，置-80 ℃保存。所有标本避免溶血和反复冻融。取180 μL血清，按miRNeasy Mini Kit试剂盒说明书操作提取miRNA，样本用30 μL DEPC处理的ddH2O

溶解，置-80 ℃保存。取2 μL总RNA，用NanoDrop 1000微量核酸测定仪测定RNA的吸光度(A260/280 nm)值，取A260/280 nm值在1.8～2.0的样本用于后续实验。

1.5 引物设计及逆转录反应 miR-130a特异性逆转录引物：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACATGCCCT′-3′；U6特异性逆转录引物：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACGATT-3′。均由上海吉凯基因化学公司设计并合成。按照TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒说明书操作将总RNA逆转录成cDNA。样本置-20 ℃保存。

1.6 荧光定量PCR检测血清miRNA-130a的表达 miR-130a上游引物序列： 5′-GGGGCAGTGCAATGTTAAAA -3′；下游引物序列：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6上游引物序列： 5′-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3′； 下游引物序列： 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。 均由上海吉凯基因化学公司设计并合成。按照TaqMan MicroRNA Assay试剂盒说明书操作检测miR-130a的表达水平。PCR反应体系为20 μL，包括10×PCR buffer 2 μL，25 mmol/L MgCl21.2 μL，10 mmol/L dNTP 0.4 μL，10 mmol/L上、下游引物各0.5 μL，Taq酶 0.4 μL，模板cDNA 1 μL，无RNA酶ddH2O 14 μL。PCR循环参数：94 ℃变性5 min； 94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共40个循环。在60 ℃下采集荧光信号，并用7500 software V2.0.6软件进行熔解曲线分析。每份样品设3个复管，Ct值取2次PCR反应的平均值。血清miR-130a的表达水平用2-ΔCt法计算。

2 结果

2.1 各组宫颈癌患者血清miR-130a的表达水平 荧光定量PCR检测结果表明，宫颈癌患者血清中miR-130a的表达水平(0.087±0.038)明显高于体检健康者(0.029±0.024)，差异有统计学意义(t=-9.74，P<0.01)。进一步对15例随访宫颈癌患者术后1个月血清miR-130a水平进行检测，结果显示，术前血清miR-130a表达水平为(0.082±0.014)，术后为(0.033±0.022)，两组间差异有统计学意义(t=8.408，P<0.01)。此外， 25例Ⅲ～Ⅳ期宫颈癌患者血清miR-130a表达水平(0.105±0.038)明显高于35例Ⅰ～Ⅱ期宫颈癌患者(0.074±0.034)，差异具有统计学意义(t=-3.24，P=0.002)。低分化宫颈癌患者血清miR-130a表达水平(0.107±0.034)高于高中分化宫颈癌患者(0.066±0.032)，差异具有统计学意义(t=-4.785，P<0.01)。血清miR-130a的表达水平在宫颈癌鳞癌患者(0.087±0.037)与腺癌患者(0.087±0.042)之间的差异无统计学意义(t=-0.065，P=0.948)。

2.2 血清miR-130a表达水平与宫颈癌临床病理参数的关系 根据参考文献[7-8]，以宫颈癌患者血清miR-130a表达水平高于体检健康者3.02倍作为界值，分为低表达(<3.02倍)和高表达(≥3.02倍)。宫颈癌患者血清miR-130a表达水平与患者年龄、肿瘤直径及HPV感染无关(P>0.05)，但与肿瘤分化程度(P<0.01)和FIGO分期(P=0.01)密切相关。见表1。

表1 miR-130a与宫颈癌患者临床病理参数的关系

2.3 血清miR-130a表达水平在宫颈癌诊断中的价值 以60例宫颈癌患者作为疾病组，60例体检健康者和38例慢性宫颈炎患者作为对照组，分析血清miR-130a诊断宫颈癌的效能，结果表明，ROC曲线下面积(AUCROC)为0.878，95%可信区间(CI)为(0.809～0.947)。当cut-off值为0.05时，其敏感性为86.7%，特异性为90.8%。见图1。

图1 血清miR-130a诊断宫颈癌的ROC曲线

3 讨论

研究表明，在肺癌、肝癌和卵巢癌等肿瘤组织中均发现miR-130a的表达水平升高，并进一步证实了其可促进肿瘤细胞的增殖、浸润和转移，可作为肿瘤早期诊治的新指标[9]。另有学者发现，miR-130a在宫颈癌细胞中的表达水平异常升高，并可通过激活NF-κB等信号通路促进癌细胞增殖和侵袭转移[4]。血清miR-130a在宫颈癌诊断方面的报道较少，且因其发挥致癌基因的作用，故本研究选择血清miR-130a用于宫颈癌诊断研究。

本研究采用荧光定量PCR检测宫颈癌患者和体检健康者血清miR-130a表达水平，结果表明miR-130a在宫颈癌患者血清中呈高表达，与其他文献报道的miR-130a在宫颈癌组织中表达水平升高较为一致[4-5]。分析宫颈癌患者血清miR-130a表达升高的原因，可能是癌细胞的死亡和溶解，或由癌细胞释放出miR-130a至血液循环中所致。在临床实践中，外周血采集方便且具有创伤小、可重复等优点，且miRNA稳定性强，因此，血清miR-130a有望成为宫颈癌诊断的分子标志物。

此外，本研究通过分析宫颈癌患者血清miR-130a表达水平与临床病理参数之间的关系，结果表明血清miR-130a表达在患者年龄和病理类型方面

差异无统计学意义，但在肿瘤分化程度和FIGO分期方面存在差异，表明miR-130a可能发挥促进宫颈癌发展的作用。随着肿瘤的进展，miR-130a表达呈现进一步升高的趋势，Ⅲ～Ⅳ期患者血清miR-130a的相对表达水平较Ⅰ～Ⅱ期患者明显升高。此外，宫颈癌患者术后血清miR-130a表达水平较术前明显降低，说明miR-130a可能用于宫颈癌术后判断。血清miR-130a诊断宫颈癌的AUCROC为0.878，敏感性为86.7%，特异性为90.8%，提示血清miR-130a有望成为宫颈癌诊断的一种新型肿瘤标志物。虽然本研究检测的样本例数没有达到大样本的要求，但可为今后的大样本研究提供实验依据。

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(本文编辑：许晓蒙)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.08.08

2016年泰州市人民医院院级课题指令性项目(ZL201617)。

沙敏，1986年生，女，主管技师，硕士研究生，主要从事临床肿瘤及相关检验项目研究。

汪佳，副主任医师，E-mail:32735644@qq.com。

R711.74

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2017-05-15)