梁恒宇,王贵元,郭坤,史孟琦,陈傲冰
(1.武汉生物技术研究院,武汉 430075;2.武汉大学药学院,武汉 430072;3.黑龙江大学生命科学学院,哈尔滨 150080;4.现代牧业集团有限公司,哈尔滨 150614)
含Nisin复合型牛乳头清洗消毒剂在大型牧场应用效果的研究
梁恒宇1,2,王贵元1,郭坤3,史孟琦1,陈傲冰4
(1.武汉生物技术研究院,武汉 430075;2.武汉大学药学院,武汉 430072;3.黑龙江大学生命科学学院,哈尔滨 150080;4.现代牧业集团有限公司,哈尔滨 150614)
乳酸链球菌素(Nisin)是一种食品级抗菌肽,对革兰氏阳性细菌引起的奶牛环境性、传染性乳房炎具有明显治疗作用。本研究以Nisin为主要成分的复合型奶牛乳头专用清洁消毒类产品为研究对象,对其在大型牧场的实际应用效果进行了长期跟踪测试。结果表明,含Nisin复合型牛乳头清洗消毒剂不仅杀菌率高,而且还能有效降低受试牧场乳房炎发病率和鲜奶中的体细胞数,并且能够控制鲜奶中的微生物数量。同时,与碘伏相比,该产品还具有较低的使用单耗,从而显著降低牧场生产成本。
大型牧场;奶牛乳房炎;牛乳头清洗消毒剂;乳酸链球菌素
乳房炎是严重影响奶牛养殖业的三大疾病之一,是奶牛乳房因受到物理、化学、微生物等因素的剌激而产生的一种炎症[1]。乳房炎不仅能引起奶牛乳腺组织发生病变,导致乳汁发生理化和细胞学性质改变,在实际生产中还会造成奶牛产奶量下降和奶品质降低,严重时奶牛会因泌乳机能完全丧失而被淘汰[2]。在众多诱发因素中,病原微生物经乳头管侵入乳腺组织是导致奶牛乳房炎的主要病因[3]。据报道,能够导致奶牛罹患乳房炎的致病微生物已超150种,其中包括细菌、真菌、病毒、支原体等各类病原体[4]。
对奶牛乳房炎的防治应采取综合性措施。其中每次挤奶前和挤奶后分别使用专门产品对奶牛乳头进行清洁消毒是国际上通用的且行之有效的方法[5],这对乳房炎的预防起着关键作用[6]。目前行业内经常使用的乳头消毒产品中主要的杀菌成分包括碘[7]、醋酸氯己定、新洁尔灭、次氯酸钠、过氧乙酸和高锰酸钾等[8]。其中碘伏等含碘类消毒液因其杀菌效果好而最为广泛使用。但碘容易挥发,长期使用高浓度含碘制剂还存在奶中碘超标的风险[9]。而其他非含碘类的消毒液存在着安全性较低、杀菌率较差、稳定性较弱或对奶牛皮肤刺激性较强等问题[10]。因此,急需开发出一种更加安全、天然且对皮肤无刺激的新一代奶牛乳头消毒类产品[11]。
目前国际上关于以乳酸链球菌素(Nisin)作为主要杀菌成分的乳头消毒剂的研究极少,但已有的研究表明,这类产品与含碘量为1.0%的碘伏消毒剂的使用效果基本一致,比含碘量为0.1%、0.5%的碘伏和0.5%葡萄糖酸氯己定的效果更显著[12]。Nisin作为一种食品级抗菌肽,对革兰氏阳性细菌引起的奶牛环境性和传染性乳房炎具有明显治疗作用的效果已被证明[13]。本研究对以Nisin为主要成分的复合型奶牛乳头专用清洁消毒类产品为研究对象,对其在大型牧场的实际应用效果进行了长期跟踪测试,为更好地使用和推广该产品提供了详实的参考依据。
1.1 奶牛乳头清洗消毒剂产品
本研究试验组所采用的乳头消毒产品为以Nisin为主要成分的复合型奶牛乳头清洗消毒剂(命名为A产品),由齐齐哈尔安泰生物工程股份有限公司生产和提供。该产品分挤奶前和挤奶后两种剂型。其中挤奶前产品为300g/瓶的粉末状固体,将1瓶挤奶前产品加入20L水中,充分溶解5~10min后即可使用;挤奶后产品为25kg/桶的黏稠液体,可直接使用。对照组产品为美国某大品牌碘伏类乳头消毒液,挤奶前和挤奶后产品均为棕褐色浓稠液体。
1.2 试验时间及场地
本研究试验期为2014年5月~2016年7月,共计27个月。研究分两个阶段:第一阶段为2014年5月1日~2015年5月31日,牧场全群使用美国某大品牌碘伏类消毒液,总计13个月;第二阶段为2015年6月1日~2016年7月30日,全群改用A产品,总计14个月。试验地点为黑龙江省哈尔滨市周边某大型牧场。该牧场泌乳牛常年保持在3 500头左右。
1.3 试验方法
1.3.1 奶牛乳头皮肤表面微生物总数的测定及分析
每月上、中、下旬分别随机挑选4~6头健康泌乳奶牛对其乳区擦拭取样。分别在消毒前、挤前消毒后(乳头浸渍挤奶前产品20~30s后)和挤后消毒后这三个节点用无菌湿润棉签在一个乳区的乳头导管周围皮肤约4cm2表面轻柔地涂擦6~8下,其间不断转换棉签的擦拭面。采样后剪掉棉签取样端并使其立即掉入装有10mL无菌生理盐水的离心管中并封盖,迅速将样品转移至实验室进行10倍梯度稀释。吸取适当稀释梯度的稀释菌悬液100μL滴加到平板上进行涂布[14]。然后将平板平移至37℃培养箱中培养48h后进行菌落计数和统计,计算杀菌率。
1.3.2 牧场主要生产内控指标监测
根据牧场每日的生产内控指标监测记录,分别按月统计牧场泌乳牛乳房炎月发病率、鲜奶中月平均体细胞数、鲜奶中月平均微生物总数和单头奶牛消毒液日耗费的月平均值,并对两个阶段的统计数据进行比较分析。
1.3.3 数据处理与统计
数据统计由SPSS 17.0软件完成。
2.1 奶牛乳头清洗消毒剂杀菌能力的测试
本研究对受试牧场奶牛乳头皮肤使用消毒产品前后微生物总数的变化进行了长达14个月的监测。为了比较,在全群转用A产品前的一个月(2015年5月)先对碘伏类消毒液的杀菌能力进行了测定,先后对18头牛进行了采样和分析(表1)。在随后的13个月内(2015年6月~2016年6月),在全群使用A产品后,对其杀菌能力进行了测定,其三个采样节点乳头皮表单位面积上的微生物总数月均值见表1所示。
表1 使用消毒液前后奶牛乳头皮肤表面微生物数量及杀菌率
从表1可以看出,无论是碘伏产品,还是以Nisin为主要原料的A产品,均能有效杀灭和控制乳头皮肤上的微生物数量。使用碘伏的单月平均数据显示,消毒前乳头皮表的微生物平均数量达1.31×107CFU/cm2,挤奶前消毒后降至1.20×106CFU/cm2,挤奶后消毒后又降至9.60×104CFU/cm2。使用碘伏挤前消毒后、挤后消毒后的平均杀菌率分别为90.84%和99.28%。
在全群改用A产品后,研究人员同样发现该品牌挤奶前和挤奶后产品对奶牛皮肤表面的微生物同样具有较好的杀灭作用,不同月份挤奶前消毒后和挤奶后消毒后平均杀菌率分别在79.98%~97.76%和98.58%~99.77%,与碘伏消毒液基本一致。从表1的数据还能得知,在使用A产品后,奶牛乳头皮表微生物数量有明显的渐进下降趋势。与2015年5月的数据相比,在使用A产品后的第一个月,奶牛乳房皮表微生物总数便降至6.31×106CFU/cm2,至2016年3月降至最低的3.56×104CFU/cm2,下降近177倍。进入4月随着季候的变化又缓慢增加至3.24×105CFU/cm2。这可能是由于随着温度的升高,环境中微生物数量增加造成的。
2.2 牧场不同阶段使用不同类型消毒剂乳房炎发病率的变化
图1 牧场不同阶段使用不同类型消毒剂的乳房炎月发病率
挤奶过程中使用消毒剂对奶牛乳头进行消毒是预防乳房炎的关键步骤。本研究所在牧场乳房炎发病率变化总体呈现夏季较高,秋季至冬季逐渐降低,进入春季又开始缓慢升高的趋势。从图1中可以看出,牧场在第一阶段使用碘伏时,乳房炎发病率最高为2014年8月的4.8%,最低为2015年1月的2.2%;在第二阶段使用A产品后,奶牛乳房炎发病率最高为2015年7月时的4.4%,而最低为2016年的7月的1.4%,这一数值是该牧场建场7年以来的历史最低值。
从图1还可以看出,2015年在第二阶段启用新消毒剂后,牧场乳房炎月发病率相比第一阶段同期高的月份只有两个,即最初的6月和7月。这两个月的乳房炎发病率分别为3.2%和4.4%,比第一阶段同期(2014年6月和7月)仅分别高出0.1个百分点和0.2个百分点。而其他月份使用A产品后的乳房炎发病率均比第一阶段相同月份时低。尤其是2015年11月、12月,以及2016年2月、3月、4月和5月,分别比2014年11月、2014年12月、2015年2月、2015年3月、2015年4月和2015年5月低1.0、0.4、0.7、1.6、0.8和1.3个百分点。
图1的结果还表明:2014年5月、2015年5月以及2016年5月这三个月份的乳房炎发病率分别为3.0%、3.2%和1.9%,这其中2014年5月和2015年5月使用的均是碘伏,而2016年5月使用的是A产品;2014年6月、2015年6月以及2016年6月这三个月份的乳房炎发病率分别为3.1%、3.2%和2.1%,这其中2014年6月使用的是碘伏,2015年6月和2016年6月使用的是A产品,而2015年6月是该牧场首次使用该产品,与2014年和2015年同期相比,2016年6月的发病率降低了1.0和1.1个百分点;2014年7月、2015年7月和2016年7月这三个月份的乳房炎发病率分别为4.2%、4.4%和1.4%,这其中2014年7月份使用的是碘伏,2015年7月份和2016年7月份使用的是A产品,与2014年和2015年同期相比,2016年7月的发病率降低了2.8和3.0个百分点。从以上数据可以看出,在使用碘伏时,不同年份的同一月份,牧场乳房炎发病率没有显著变化,而使用A产品一年后,牧场乳房炎发病率显著下降。
2.3 牧场不同阶段使用不同类型消毒剂鲜奶中体细胞数的变化
牧场在不同阶段鲜奶中月度平均体细胞数(SCC)变化情况见图2所示。在第一阶段的研究中,13个月中SCC均值低于20万个/mL的有3个月份,其中最低值(19.6万个/mL)出现在2015年4月;而在第二阶段中,14个月中SCC均值低于20万个/mL的有13个月份,其中最低值(18.8万个/mL)出现在2016年4月。而且,2015年6月~2016年5月的数据与2014年同期相比均较低。其中,2015年8月份平均SCC较上年同期低3.50万个/mL,同比下降达15%。
统计结果显示,在整个第二阶段使用A产品的过程中,受试牧场的SCC均值为19.50±0.52万个/mL,与第一阶段的21.64±1.54万个/mL相比,二者之间存在极显著差异(P<0.01)。以上结果表明,A产品具有有效降低牧场鲜奶中体细胞数的作用。
图2 牧场不同阶段使用不同类型消毒剂的鲜奶中月平均体细胞数
2.4 牧场不同阶段使用不同类型消毒剂鲜奶中微生物数量的变化
图3 牧场不同阶段使用不同类型消毒剂的鲜奶中月平均微生物数量
鲜奶中的微生物数量可反映出泌乳牛乳腺的健康状况和挤奶时的环境卫生情况。从图3可以看出,2015年5~8月,受试牧场鲜奶中微生物数量逐渐上升,这与上一年度同期的数据结果不同。但2015年9~11月,该牧场鲜奶中的微生物数逐渐下降,并且低于2014年同期水平。2015年11月该牧场鲜奶中微生物数量平均为0.59万个/mL,与当年8月份相比下降了31.4%。
从图3可以看到,在整个研究阶段,牧场所有月份生产的鲜奶中平均微生物数均低于1万个/mL,最低值出现在开始使用A产品的第一个月(2015年6月),数值为0.43万个/mL。以上数据也同样证明,A产品不仅能够很好地控制奶牛乳房炎发病率,同时能够降低鲜奶中微生物总数,从而提高原奶的质量。
统计结果显示,在分别使用碘伏和A产品的情况下,两个不同阶段鲜奶中微生物均数分别为0.73±0.12万个/mL、0.65±0.13万个/mL,二者之间并无显著性差异。以上分析结果表明,A产品和含碘消毒液同样具有良好的控制鲜奶中微生物的作用。
2.5 牧场不同阶段使用不同类型消毒剂单头奶牛消毒剂平均日耗费的变化
图4 牧场不同阶段使用不同类型消毒剂的单头奶牛消毒剂日耗费
乳头消毒剂的使用成本是牧场关心的重要问题。经过综合成本核算,使用A产品消耗费用均可维持在1.00元/(头·d),最低时仅为0.63元/(头·d),最高时为0.99元/(头·d)。而使用原碘伏产品的消耗费用在13个月内有5个月超过了1.00元/(头·d),最低时为0.74元/(头·d),最高时达到1.14元/(头·d),详见图4。
对两个阶段月消毒液费用单耗进行统计分析,结果表明使用碘伏和A产品的平均单耗分别为0.99±0.10元/(头·d)、0.85±0.09元/(头·d),二者存在显著差异(P<0.05)。与第一阶段使用碘伏相比,使用A产品后单头奶牛每日消毒液的消耗成本降低了14.14%。该牧场每天的泌乳牛头数为3 500头,按照统计均值计算,使用A产品可为牧场节约药浴费用达17.89万元/年。
作为奶厅挤奶操作规程中的关键控制点,对乳头进行清洗和消毒是牧场控制环境性和传染性病原的重要手段之一,其效果直接影响到乳房炎的发病率[15]。杀菌率是判断这类产品质量的重要依据,因此客观评价产品的杀菌效果具有重要意义[16]。奶牛在两次挤奶期间会在饲舍停留8~12h,这期间奶牛会在卧床上躺卧,因此卧床上的环境微生物会黏附在乳头皮肤上。每次挤奶前,对奶牛乳头进行前药浴处理是为了清洗掉奶牛乳头皮肤上的泥土、碎屑等污物,同时杀灭微生物。使用后药浴,是为了在乳头孔闭合前保护乳腺免受病原体的侵害。本研究证明A产品具有良好的杀菌能力,挤奶前和挤奶后产品对乳头皮表微生物的杀灭率分别在79.98%~97.76%和98.58%~99.77%,与含碘类消毒剂相似。无论哪种类型的消毒剂,药浴后的杀菌率都不可能达到100%,这是由于奶厅的环境卫生、毛巾的洁净程度以及工人的操作习惯等因素都会导致微生物残留,因此药浴后仍能在乳头皮肤上分离到一定数量的微生物[17]。
Nisin是一种由34个氨基酸组成的食品级抗菌肽,通过干扰细胞膜的正常功能并造成膜穿孔而对革兰氏阳性细菌具有高效的杀灭作用[13]。其与螯合剂复配可以有效抑制革兰氏阴性细菌的生长[18]。Nisin是A产品的主要杀菌成分。此外,该产品中还含有食品级螯合剂、增效剂和有机酸等物质,可以有效扩展Nisin的抑菌谱。有报道称,使用含有Nisin的消毒剂与碘伏奶牛皮表的杀菌率无明显差异,但使用前者后乳头的状态与后者相比略有改善[19]。这与本研究所得结果一致。本文通过对大型牧场长期的临场应用研究和跟踪测试,不仅证明了A产品和碘伏同样具有很高的杀菌率,而且长期使用该产品能够起到降低皮肤微生物总数的作用,从而对乳腺可以起到充分的保护。
乳房炎发病率是牧场最为关心的生产数据。大型牧场乳房炎月发病率<2%为优秀,<4%为可接受。快速高效的挤奶前消毒,配合挤奶后成膜消毒液在乳头上的长时间保护,再加上合理的牛群管理措施,可以有效预防乳房炎。本研究证明,A产品能够有效防控牧场乳房炎的发病率。与传统的碘消毒液相比,经过连续两个月的全群使用后,使得受试牧场乳房炎月发病率出现持续降低。使用一年左右,乳房炎发病率与使用含碘消毒液的历史同期相比下降幅度超过30%,效果十分显著。
体细胞数是反映乳腺健康状况的重要指标,一般奶牛乳中SCC高于20万个/mL便有可能感染乳房炎。SCC还与奶牛的泌乳阶段、季节、年龄、感染细菌的种类和数量有关。关于乳中SCC的上限美国规定是75万个/mL,欧盟是40万个/mL。2015年我国牛奶中SCC平均值已降至51万个/mL。在本研究中,从受试牧场SCC指标来看,A产品的表现也优于碘伏类产品。在使用含碘消毒剂的13个月里,平均SCC为21.64±1.54万个/mL;而改用A产品后,13个月的平均SCC降至19.51±0.53万个/mL。二者之间具有显著性差异。
鲜奶中的微生物总数是牧场管理的另一项重要指标。研究结果表明,A产品与碘伏在这一指标上没有差异,这两种产品均能将受试牧场鲜奶中的微生物数量控制在0.70万个/mL左右的水平。
从使用成本上看,A产品与碘伏相比也略占优势。统计结果表明,长期使用A产品可以使牧场药浴成本下降14.14%。这一差异,将为大型牧场每年节约十余万甚至数十万元的成本。
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Abstract:Nisin is a kind of food grade antibacterial peptide. It has obvious therapeutic action on the environmental and infectious mastitis caused by gram positive bacteria in dairy cattle. In this work, the specific cleaning and disinfection product of teat dip with Nisin as the main component was studied, and the long-term effects of its application on large farms were tested. The results showed that the teat dip containing Nisin could not only increase the bactericidal rate on cow nipple skin, but also effectively reduce the number of somatic cells, the incidence of mastitis and the number of microorganisms in fresh milk. At the same time, compared with iodophor, this product showed lower unit consumption, thus signifcantly decrease application costs of dairy farms.
Application of Compound Teat Dip Containing Nisin in a Large Dairy Farm
LIANG Heng-yu1,2, WANG Gui-yuan1, GUO Kun3, SHI Meng-qi1, CHEN Ao-bing4
(1. Wuhan Institute of Biotechnology, Wuhan 430075; 2. Wuhan University School of Pharmaceutical Sciences, Wuhan 430072; 3. Heilongjiang University College of Life Sciences, Harbin 150080; 4. Modern Farming (Group) Co., LTD, Harbin 150614)
Large dairy farm; Bovine mastitis; Teat dip; Nisin
S858.23
A
1004-4264(2017)08-0029-05
10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.08.007
2016-08-10
梁恒宇(1980-),男,博士,主要研究方向为病原微生物和食品生物技术。