奶牛乳房炎耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性及mecA耐药基因分型研究

钟召兵，侯磊，孙红华，王宁，杨夫会，李庆雷

(1.泰安市岱岳区畜牧兽医局，泰安 271000；2.泰安市畜牧兽医局，泰安 271000；3.山东高速生物工程有限公司，济南 250000 )

奶牛乳房炎耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性及mecA耐药基因分型研究

钟召兵1，侯磊2，孙红华1，王宁1，杨夫会1，李庆雷3

(1.泰安市岱岳区畜牧兽医局，泰安 271000；2.泰安市畜牧兽医局，泰安 271000；3.山东高速生物工程有限公司，济南 250000 )

为了解奶牛场乳房炎金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.aureus）的耐药性，并对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的耐药基因进行研究，本研究采集奶牛场临床型乳房炎奶样89份进行金黄色葡萄球菌分离鉴定及药敏试验，采用K-B法检测其对常用13种抗生素的敏感性；利用双重PCR扩增MRSA的nuc基因和mecA耐药基因；应用基因外重复回文序列（repetitive extragenic palindromic elements, REP）PCR对分离菌株进行基因多样性分析。结果显示，共分离到16株MRSA；在监测的13种药物中，耐药率超过50%的达到10种，其中对头孢曲松（CRO）、头孢噻肟（CTX）、环丙沙星（CIP）和亚胺培南(IPM)耐药率高达93.75%（15/16），但未见对头孢呃酮（SCF）耐药的分离菌株；耐药基因检测结果显示，16株菌中都携带有mecA耐药基因，除1株外其他15株分离菌都携带特异致病nuc基因。REP-PCR把分离菌株分为13种基因型（A-M），同源性≥90%的只有6株菌。研究结果表明，奶牛乳房炎金黄葡萄球菌的多重耐药比较严重，分子多样性复杂，mecA是其耐甲氧西林类药物的重要机制，本研究为MRSA耐药菌的有效检测及奶牛乳房炎的治疗提供了科学依据。

奶牛乳房炎；金黄色葡萄球菌；mecA基因；REP-PCR；基因型

奶牛乳房炎是一种常见且复杂的疾病，严重影响奶牛奶产量及牛奶品质，并且影响公共食品卫生安全[1]。引起奶牛乳房炎的主要致病菌为金黄色葡萄球菌、链球菌和大肠埃希氏菌[2]。其中，金黄色葡萄球菌性乳房炎发病率最高，多呈慢性经过，其特异性致病基因是nuc基因。值得注意的是，金黄色葡萄球菌中含有耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA），mecA基因是MRSA的耐药基因。MRSA导致的乳房炎难以被治愈，患牛通常被淘汰，严重影响养殖场的经济效益。

本研究以奶牛场乳房炎患牛的新鲜奶样为试验材料，分离鉴定金黄色葡萄球菌，并对MRSA耐药菌株的耐药性、耐药基因和分子多样性进行系统研究，为奶牛乳房炎的有效鉴定和治疗提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验样品

本研究以泰安市5个奶牛场的临床型乳房炎患牛为试验动物，无菌采集38头（次）奶牛的新鲜奶样，进行细菌分离培养和鉴定。

1.2 试验方法

1.2.1 采集奶样、预培养

用50mL无菌离心管采集奶样，加入等体积的TBS肉汤（含15%NaCl），充分混匀，37℃培养18～24h。

1.2.2 细菌分离培养

将样品与培养液接种到高盐甘露醇琼脂培养基（杭州天河）、37℃培养18～24h，挑取橘黄色的菌落接种到Baird-park琼脂培养基上纯培养一次，然后用API 20E（Bio Merieux, Marcy-I’Etoile, France）鉴定。

1.2.3 药物敏感试验

采用美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）推荐的K-B法检测阿米卡星(AK)、头孢他啶(CAZ)、环丙沙星(CIP)、庆大霉素(CN)、头孢曲松(CRO)、头孢噻肟 (CTX)、头孢替坦(FEP)、亚胺培南(IPM)、美罗培南(MEM)、氨苄西林(SAM)、头孢哌酮(SCF)、复方新诺明(SXT)、哌拉西林 (TZP)）共13种常用抗菌药物的敏感性。结果判定及质量控制按2010年CLSI标准进行。

1.2.4 MRSA特异性基因nuc和mecA耐药基因的检测

按细菌基因组提取试剂盒操作说明书提取细菌DNA，提取后的产物于-20℃ 保存备用。双重PCR扩增MRSA特异性基因nuc和mecA耐药基因，引物由上海生工生物技术有限公司合成（表1）。50μL反应体系：10×PCR buffer 5μL，2.5mmol/L dNTP 4.0μL，20pmol/L引物各1μL，25mmol/μL MgCl23μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，DNA模板3μL，加ddH2O至50μL。扩增反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性25s，52℃退火40s，72℃延伸50s，进行30个循环；72℃延伸6min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳后进行凝胶成像系统扫描成像。

1.2.5 REP-PCR反应

引物[3]REP1（5’-ACTATTCCCTCAGGCTCC-3’）和REP2（5’- GGAGTTAATCTACGTCTCATC -3’）均由大连宝生物公司合成。反应体系为25uL，其中10×PCR buffer 2.5μL，2.5mmoL/L dNTP 2.0μL，20pmol/L引物各1μL，25mmol/μL MgCl21.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，DNA模板1.5μL，加ddH2O至 25μL。扩增的反应条件为：94℃预变性5min，然后94℃变性1min，56℃退火45s，72℃延伸5min，35个循环，65℃延伸10min后结束反应。

1.2.6 REP-PCR聚类分析

将REP-PCR电泳图谱用Gel-Proanalyzer3.1软件精确确定每条条带分子量大小后，采用非加权对数算术平均法(unweighted pair group method using averages algorithm, UPGMA)，利用SAS8.0软件进行聚类分析。另外，将每一个分离株看作是一个分类学单位(operational taxonomic unit, OUT)，并且把相似性≥90%的菌株看作起源相同的菌株[4]。为了减少误差，所有菌株在同一个反应条件下一次完成，电泳也在同一块凝胶中一次完成。

2 结果

2.1 MRSA分离株对常用13种药物的敏感性

表2 MRSA对13种常用抗生素耐药性分析

本研究从奶牛场乳房炎患牛的新鲜奶样中共分离到16株MRSA。16株MRSA对头孢曲松（CRO）、头孢噻肟（CTX）、环丙沙星（CIP）、亚胺培南（IPM）的耐药率为93.75%（15/16），对复方新诺明（SXT）的耐药率为87.5%（14/16），对庆大霉素（CN）、哌拉西林（TZP）的耐药率为81.25%（13/16），而对阿米卡星（AK）、头孢替坦（FEP）、头孢他啶（CAZ）的耐药率分别为75%（12/16）、68.75%（11/16）、62.5%（10/16），对氨苄西林(SAM)、美罗培南(MEM)的耐药率分别为43.75%（7/16）、37.5%（6/16），但对头孢哌酮(SCF)几乎都敏感或中度敏感（表2）。

2.2 MRSA的mecA耐药基因检测结果

16株菌均含有mecA耐药基因，除了第15株分离菌外，其他的菌株均含有nuc特异性致病基因（图1）。

图1 双重PCR检测结果

2.3 REP-PCR对16株MRSA的检测结果

16株MRSA进行REP-PCR分子分型，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后呈现不同带型，同一种细菌可出现泳动速率各异的数条带行，一般扩增除4～9条条带，所获的分子量大小在109～2 212kb之间。根据每个聚类群内部和聚类群之间菌株的遗传距离相同或很相近，16株MRSA可分为13种基因型，分别是A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M。它们之间的同源性在57%～92%之间，大部分菌株间相似性低于90%，同源性大于90%的有菌株3和4、7和8以及9与10（图2）。

3 讨论

MRSA像一般的细菌一样广泛存在于水、土壤，甚至动物和人体的表面。在机体抵抗力强时不会发作，而一旦机体抵抗力下降，它可通过多种途径侵入机体，导致皮肤或器官的多种感染，甚至败血症；也能产生多种毒素，引起食物中毒、毒性休克症和假膜性肠炎等疾病[5]。该菌对目前临床上所使用的大多数抗生素有很高的耐药率和多重耐药性，除对甲氧西林耐药外，对绝大多数β-内酰胺类抗生素呈交叉耐药，并可对氨基糖苷类、大环内酯类等常用抗生素产生多重耐药，极易引起感染的暴发流行，给临床治疗带来极大困难，已成为世界关注的难题。鉴于它的严重性，美国已将其列入传染病管理。

在本研究中，16株MRSA对亚胺培南(IPM)的耐药率是93.75%，远远高于2010年中国卫生部细菌耐药监测报告所公布的数据。这与中国上海和陕西地区的研究结果一致[6,7]。这表明MRSA对IMP的耐药性呈明显增高趋势。MRSA分离菌株对10种常用抗生素的耐药率都大于60%，这说明本地区MRSA耐药形势十分严峻。值得一提的是，16株分离菌都对头孢哌酮(SCF)敏感或中度敏感。但是以往的研究表明MRSA对头孢哌酮(SCF)耐药的上升速度非常快。因此，在应对该菌感染时，需要更有效的药物和方案。

本研究中所分离的16株MRSA都携带mecA基因，这与mecA基因是MRSA的固有基因有关[7]。本研究利用了REP-PCR对MRSA进行分型[2,8]，16株菌分为13种基因型，而根据菌株的遗传距离相同或接近，A型与B型、D型与E型、I型与J型之间的亲缘关系较近；发现同一牛场中不同个体的分离株，也可以存在不同基因型；而不同牛场的分离株也可属于同一基因型。同时也出现了遗传距离较远的、亲缘关系相差较大的菌株。这表明MRSA来源更为广泛，不同地区、不同环境和条件下同一种病原菌的基因型也存在一定差异，可能存在多个MRSA的基因型[9]。

图2 据REP-PCR做出的MRSA遗传关系聚类树状图

规模奶牛养殖场奶牛乳房炎的MRSA往往被人们所忽略。但是本研究的结果表明，从奶牛乳房炎患牛分离的MRSA的耐药情况很严重，而且基因型多且同源性较低。因此需要采取有效的措施来控制MRSA耐药基因的散播。

[1] 米耀荣,郭生泉,张勇,等.奶牛乳房炎的危害及其防治措施[J].畜牧与饲料科学,2009,30(10)：163-164.

[2] 周利青.奶牛乳房炎的发病原因及治疗[J].吉林畜牧兽医,2011,3：33-34.

[3] Versalovic J, Kapur T, Lupski R. Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application fingerprinting of bacterial genomes[J]. Nucleic Acids Res, 1991, 19：6823-6831.

[4] Snelling AM, Gerner-smidt P, Hawkey PM, et al. Validation of Use of Whole-Cell Repetitive Extragenic Palindromic Sequence-Based PCR (REP-PCR) for Typing Strains Belonging to the Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii Complex and Application of the Method to the Investigation of a Hospital Outbreak[J]. J Clin Microbiol, 1996, 34：1193-1202.

[5] 李振民.奶牛隐性乳房炎的防治[J].畜牧兽医杂志,2005,3：31-32.

[6] 张峥臻,徐国忠,张克春.上海某奶牛场乳房炎病原菌分离鉴定及药敏试验[J].上海畜牧兽医通讯,2009,3：18-19.

[7] 倪春霞,蒲万霞,胡永浩,等.奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定及耐药性分析[J].西北农林学报,2010,19(2)：20-24.

[8] 鲁卫平,安琳.双重PCR反向杂交快速检测及鉴定耐甲氧西林金黄色葡萄球菌[J].检验医学,2004,19(5)：396-398.

[9] Amudhan SM, Sekar U, Arunagiri K, et al. OXA beta-lactamasemediated carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii[J].Indian J Med Microbiol, 2011, 29：269-274.

Typing of MecA gene and Meticillin-resistant Staphylococcus aureus Resistance in Cow Mastitis

ZHONG Zhao-bing1, HOU Lei2, SUN Hong-hua1, WANG Ning1, YANG Fu-hui1, LI Qing-lei3
(1.Tai,an Daiyue District Animal Husbandry and Veterinary Bureau, Tai,an 271000; 2.Tai,an District Animal Husbandry and Veterinary Bureau, Tai,an 271000; 3. Shandong High Speed Biological Engineering Limited Company, Jinan 250000)

The purpose of this study is to understand the drug resistance of S.aureus within a dairy farm and study mecA resistant genes of MRSA.Totally 89 samples were Collected from the dairy dominant mastitis milk samples were employed for separation and identifcation of S.aureus,as well as the drug susceptibility test. K-B method was used to detect the sensitivity of 13 kinds of antibiotics,nuc gene and mecA resistance gene of MRSA amplifed by duplex PCR. The repetitive extragenic palindromic elements, PCR, REP-PCR method was applied to analyze gene diversity of S. aureus isolated.We were isolated from 16 MRSA strains, in the detection of the 13 drugs, the drug resistance rate of 10 kinds was more than 50%, the drug resistance rates of CRO, CTX, CIP, and IPM were as high as 93.75% (15/16), but there was no isolated strain of SCF resistance. The results of drug resistance gene detection showed that 16 strains were carrying pathogenic gene nuc, 15 strains were all carrying the mecA resistance gene in addition to the 1 strain.the separated strains were divided into 13 genotypes (A-M)using REP-PCR, homology of only 6 strains was over 90%. The research results showed that the multi drug resistance of S.aureus for cow mastitis was very serious and molecular diversity complex, mecA was an important mechanism in methicillin-resistant drug, provided scientifc guidance for the treatment of cow mastitis and effective detection of MRSA.

Cow mastitis; S.aureus; mecA; REP-PCR; Genotype

S858.23

A

1004-4264（2017）08-0041-04

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.08.010

2016-11-25

泰安市科技计划项目：“奶牛高产高效繁育技术集成示范”[2016]。

钟召兵（1980-），男，山东诸城人，硕士，研究方向为畜禽环境空气病原微生物的分离与鉴定。