陆地棉脱水素蛋白GhDHN1的结构特征和无序性分析

王俊娟，阴祖军，王德龙，王帅，王晓歌，樊伟丽，郭丽雪，陈超，叶武威

（中国农业科学院棉花研究所/棉花生物学国家重点实验室/农业部棉花生物学与遗传育种重点实验室，河南安阳455000）

陆地棉脱水素蛋白GhDHN1的结构特征和无序性分析

王俊娟，阴祖军，王德龙，王帅，王晓歌，樊伟丽，郭丽雪，陈超，叶武威*

（中国农业科学院棉花研究所/棉花生物学国家重点实验室/农业部棉花生物学与遗传育种重点实验室，河南安阳455000）

利用生物信息学对陆地棉脱水素蛋白GhDHN1的氨基酸组成理化性质、保守结构域K片段以及无序性进行分析。结果表明，GhDHN1蛋白无明显跨膜结构，不是分泌蛋白，其2个序列相近的K片段均具有高度亲水性，属于部分无序性蛋白。推测GhDHN1的这些结构特性与其调控棉花响应低温胁迫有关。

棉花；脱水素蛋白GhDHN1；结构特征；K片段；无序性

脱水素属胚胎发育晚期丰富蛋白 （Lateembryogenesisabundant protein,LEA）第二家族成员[1]，是植物中广泛存在的亲水性蛋白，与植物抗逆密切相关[2]。脱水素蛋白具有很强的热稳定性，在非生物逆境下可以稳定植物细胞膜结构[3]。脱水素的结构是其行使功能的前提条件，脱水素的K片段所形成的双亲性螺旋与部分变性蛋白的疏水位点相结合，起到类似于分子伴侶的作用[4]。笔者团队在陆地棉（Gossypium hirsutumL.）3叶期的真叶中克隆了棉花脱水素基因GhDHN1，试验结果显示，GhDHN1响应低温胁迫，在抗冷材料和冷敏感材料中表达水平差异显著，其表达量与棉花的抗冷性呈正相关[5]。研究还表明，GhDHN1编码的蛋白含有211个氨基酸，预测相对分子质量为23.79 kD，等电点为5.04；GhDHN1的二级结构α螺旋包含116个氨基酸残基，组成该蛋白的主体结构。但GhDHN1蛋白在棉花抗冷中所行使的具体功能尚需进一步研究，其蛋白质性质与其功能的关系尚不清楚。本研究对GhDHN1蛋白的结构特性和无序性进行分析，为探索脱水素蛋白GhDHN1的分子功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试数据库和脱水素蛋白GhDHN1序列的获取

从已公布的陆地棉基因组数据库[6]（http://cgp.ge

nomics.org.cn/page/species/index.jsp）以及王俊娟等[5]研究结果获得所需要的棉花脱水素蛋白GhDHN1序列（序列号：CotAD_58358）。

1.2 方法

1.2.1 脱水素蛋白GhDHN1跨膜结构和信号肽分析。利用在线工具TMHMM Server（http://www.cbs. dtu.dk/services/TMHMM-2.0）分析GhDHN1的跨膜结构；利用在线工具SignalP Server（http://www. cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/）分析GhDHN1蛋白质N端的信号肽。

1.2.2 脱水素蛋白GhDHN1核心结构域分析。用在线 Needle软件（http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html）将 Close[7]报道的脱水素结构域序列与GhDHN1蛋白质序列进行全局比对，分析GhDHN1保守结构域。

1.2.3GhDHN1蛋白功能结构示意图绘制。利用在线功能结构域制图软件DOG1.0[8]（http://ibs.biocuckoo.org/online.php）绘制。

1.2.4 脱水素蛋白GhDHN1固有无序性研究。利用在线工具PONDR○RVL-XT[9]（Predictors of Natural Disordered Regions,http://www.pondr.com/）分析GhDHN1蛋白的固有无序性。

2 结果与分析

2.1 脱水素蛋白GhDHN1跨膜结构和信号肽分析

由图1可以看出，GhDHN1无明显跨膜结构域（图1A），不属于跨膜蛋白，这与其具有高度亲水性的特性相符合；其N端没有信号肽段（图1B），说明GhDHN1不属于分泌蛋白。

2.2 脱水素蛋白GhDHN1核心结构域特性分析

K片段是1段由15个氨基酸残基组成的富含赖氨酸的结构域（EKKGIMDKIKEKLPG），是脱水素DHN的特征结构，每个脱水素蛋白中至少含1个K片段[10]。通过对GhDHN1与NCBI上报道的脱水素蛋白序列进行多重比较发现，依据Close[7]报道的脱水素结构域序列与GhDHN1蛋白质序列进行全局序列比对，发现GhDHN1的N端第81～88个氨基酸残基之间含有1个保守的S片段 （由8个连续的丝氨酸组成：SSSSSSSS），C端含有2个K片段，分别为位于144～158位的EKKGFLEKIKEKLPG和位于185～199的EKKGILEKIKEKLPG，分别记为K1和K2，不含Y片段（图1），符合SKn类型脱水素结构特点[7]。进一步分析表明，GhDHN1的K1的氨基酸残基组成，与大多数物种脱水素的共有结构K片段（EKKGIMDKIKEKLPG）的相似性为93.3.0%，一致性为80.0%，有3个氨基酸残基的差异，而K2的氨基酸残基组成与后者的相似性为100%，一致性为86.7%，有2个氨基酸残基不同。GhDHN1的2个K片段之间只有1个氨基酸残基不同。进一步对其理化性质进行分析发现，GhDHN1的2个K片段均富含带电和极性氨基酸，其中赖氨酸含量为33.3%，谷氨酸含量为20.0%，甘氨酸含量为13.3%，说明GhDHN1蛋白的K片段具有高度亲水性，与高粱（Sorghum bicolor）的脱水素蛋白SbDHN1的K片段特性很相似[11]。

图1 GhDHN1蛋白的跨膜结构和信号肽分析示意图

图2 GhDHN1蛋白结构域示意图

2.3 脱水素蛋白GhDHN1的无序性分析

通过无序性分析软件PONDR[9]对GhDHN1蛋白结构进行无序性分析，输出结果（图3）显示GhDHN1是1个固有无序性蛋白（Intrinsically disordered protein，IDP）。图3中纵坐标预测值大于0.5的认为趋于无序分布，小于0.5趋于有序分布[9]。图3显示，GhDHN1的211个氨基酸残基中，有109个是无序的，占总氨基酸残基数的51.66%，含有5个无序区域，分别位于氨基酸残基1～27，72～113，128～138，164～180和200～211之间，最长的无序区域位于氨基酸残基72～113之间（图3中画黑粗线的区域），包含有42个氨基酸残基。这些结果说明GhDHN1是1个部分无序蛋白。

图3 脱水素蛋白GhDHN1的PONDR预测结果

3 讨论

脱水素蛋白是高度亲水性蛋白，在植物中响应干旱、低温、盐等造成的渗透胁迫[12]，其序列富含带电和极性氨基酸残基，缺少不带电荷和非极性氨基酸残基如色氨酸和半胱氨酸[13]，特别是其保守结构域K片段富含赖氨酸，可形成α-双螺旋两亲的二级结构，这种结构具有亲水性和疏水性的双重特征[7]，可与膜和蛋白相互作用，在植物遭遇渗透胁迫时起稳定细胞膜结构的作用[14]，而Y片段一般不与膜结合，与植物的抗冷性关系不密切[15]。冷胁迫对植物造成的最大伤害主要是对细胞膜的损伤[16-17]，K片段富含带正电荷的赖氨酸，与带负电荷的细胞膜脂质头部基团相互作用，起稳定细胞膜作用[18]，可使细胞膜在低温下保持流动性，使其在低温条件下也能正常发挥作用[19]。本研究表明GhDHN1含有2个K片段，不含Y片段，这与笔者团队前期的研究结果相一致，即GhDHN1表达的蛋白可能在细胞膜附近行使功能，调控棉花响应低温胁迫[5]，据推测，这些功能与其含有2个K片段的结构具有一定相关性。

脱水素缺少有序的三级结构，属于IDP，可以在水分胁迫过程中或在低温条件下阻止蛋白质或酶的变性[20-21]，具有IDP性质的脱水素会在清除自由基和结合金属离子方面发挥双重作用[12,22]。本研究中 PONDR的输出结果显示棉花脱水素GhDHN1属于部分无序性蛋白，推测是由于GhDHN1蛋白质结构的无序性，使其在低温胁迫下具有更高的结构弹性和适应性，容易与细胞膜中的酸性磷酸脂特异结合，对细胞膜起保护作用[23]，从而使GhDHN1的积累与棉花的抗冷性呈正相关[5]，减轻低温胁迫对棉花的伤害。

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The Structure and Disordered Characteristics of GhDHN1 from Upland Cotton

Wang Junjuan,Yin Zujun,Wang Delong,Wang Shuai,Wang Xiaoge,Fan Weili,Guo Lixue,Chen Chao,Ye Wuwei*

Q754：S562.01

A

1000-632X（2017）08-0017-04

10.11963/1000-632X.wjjyww.20170821

2017-04-27 *通信作者：yew158@163.com

国家重点研发计划 “七大农作物育种”（2016YFD0100203）