阿托伐他汀对2型糖尿病小鼠肠道菌群的影响

吴琳英+邓顺有+王毅飞

【摘要】 目的 探索阿托伐他汀作用于2型糖尿病小鼠对其肠道菌群的影响。方法 20只小鼠随机按照1∶3分成对照组和模型组， 采用高糖高脂喂食及链脲佐菌素腹腔注射的15只成模模型组小鼠随机分为模型组、二甲双胍组、阿托伐他汀组， 每组5只， 二甲雙胍组和阿托伐他汀组各分别给予20 mg/kg和4 mg/kg 20 d灌胃干预。干预后收集小鼠血清及新鲜粪便， 血清检测随机血糖、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）， C反应蛋白（CRP）、内毒素（LPS）以及应用实时荧光定量核酸扩增检测系统（qPCR）绝对定量检测肠道菌群（肠杆菌、乳杆菌、双歧杆菌、拟杆菌、肠球菌和总菌）数量。结果 对照组与模型组的血糖、TC、TG、HDL-C、LDL-C、体重、CRP、LPS比较差异均具有统计学意义（P<0.05）；对照组与二甲双胍组的TC、TG、HDL-C、LDL-C、体重、CRP、LPS比较差异均具有统计学意义（P<0.05）；对照组与阿托伐他汀组的血糖、TC、TG、HDL-C、LDL-C、体重、CRP比较差异均具有统计学意义（P<0.05）。二甲双胍组与阿托伐他汀组的血糖、TC、TG、HDL-C、LDL-C、LPS比较差异均具有统计学意义（P<0.05）。各组肠道总菌比较差异无统计学意义（P>0.05）， 表明各组肠道菌群总量一致。与对照组比较， 模型组2型糖尿病肠道菌群中肠杆菌、肠球菌增加， 乳杆菌、双歧杆菌和拟杆菌减少， 且干预后具体菌属改变主要表现为：二甲双胍组和阿托伐他汀组肠杆菌和肠球菌均减少， 乳杆菌、双歧杆菌和拟杆菌增加（P<0.05）；而二甲双胍组较阿托伐他汀组更加能提高双歧杆菌和拟杆菌的数量（P<0.05）， 阿托伐他汀组较二甲双胍组更加能减少肠杆菌、肠球菌和提高乳杆菌的数量（P<0.05）。结论 阿托伐他汀可以通过减少肠杆菌和肠球菌致病菌和增加乳杆菌益生菌以及减少其代谢产物LPS来调节2型糖尿病肠道菌群， 其可能是他汀降脂药作用于2型糖尿病的机制之一。

【关键词】 2型糖尿病；阿托伐他汀；肠道菌群；炎症

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.22.074

肥胖、身体脂肪过多等不良生活习惯是导致2型糖尿病的主要因素， 2型糖尿病主要表现为胰岛素抵抗或胰岛素相对不足， 胰岛素参与脂质调控。血脂高常伴随2型糖尿病发生， 是慢性代谢综合征疾病中的主要组成部分， 已成为威胁全世界人民健康的主要问题。2型糖尿病常伴着高脂血症会增加心血管及肾脏等并发症的发生， 甚至明显增加死亡率， 因此如何从改善高脂血症防治2型糖尿病成为现在糖尿病研究领域的重点问题[1]。目前很多研究发现糖尿病和肥胖的发生发展与肠道菌群密切相关， 机制可能与肠道菌群及其代谢产物LPS参与了胰岛素抵抗、糖尿病慢性炎症反应、调节血糖血脂代谢、免疫等相关[2]。因此， 从肠道菌群角度去探索如何防治2型糖尿病已成为目前研究的热点。目前最主要的降脂药他汀类药物能有效延缓冠状动脉粥样硬化等心脑血管病变， 且已成为治疗2型糖尿病的二线药物。但目前并不清楚其是否能影响2型糖尿病的肠道菌群从而改善糖尿病。本研究通过使用阿托伐他汀干预2型糖尿病小鼠以探索其对2型糖尿病的肠道菌群的影响， 从而为降脂类药物更好地用于防治2型糖尿病提供新的思路。

1 材料与方法

1. 1 实验动物 SPF级雄性昆明小鼠20只， 体重（20±2）g， 由广东省动物中心提供， 先在检疫室检疫7 d后转入SPF级动物房。

1. 2 主要试剂 高糖高脂小鼠饲料由广东省动物中心订做（广州）， 链脲佐菌素（STZ）购于sigma公司（美国）， 盐酸二甲双胍片购于中美上海施贵宝制药公司， 阿托伐他汀片购于辉瑞公司（美国）， TC、TG、LDL-C、HDL-C、CRP的酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒购于武汉华美生物公司， LPS检测试剂盒购于上海榕柏生物技术公司， 粪便DNA提取试剂盒购于北京天根生化科技公司， 肠道菌群qPCR试剂盒iQtm SYBR Green SuperMix（BioRad公司， 美国）， 血糖仪和血糖试纸条购于强生公司（美国）。

1. 3 实验方法

1. 3. 1 2型糖尿病小鼠模型建立 2型糖尿病小鼠模型建立参照沈亚非等[3]的方法：20只小鼠随机按照1∶3分成对照组和模型组。模型组每天给予高糖高脂饮食及饮水， 连续给予30 d， 且每隔2天腹腔注射无菌的1% 链脲佐霉素（40 mg/kg）至30 d， 断尾取血检测其随机血糖≥15 mmol/L即造模成功；对照组每天给予正常饮食饮水， 且每隔2天腹腔注射等量的无菌水至30 d， 断尾取血检测其随机血糖。

1. 3. 2 干预及标本留取 15只成模模型组小鼠随机分为三组：模型组、二甲双胍组、阿托伐他汀组， 每组5只， 均正常饮食饮水。模型组不给予干预， 二甲双胍组给予二甲双胍20 mg/kg灌胃， 阿托伐他汀组给予阿托伐他汀4 mg/kg灌胃， 均干预20 d后留取小鼠新鲜粪便、血清置于-80℃低温冰箱储存。

1. 3. 3 血糖血脂及炎症检测 血糖采用血糖仪及试纸进行随机血糖检测， 血脂指标（TC、TG、LDL-C、HDL-C）使用血清在全自动生化仪检测得到， 炎症指标（CRP）使用血清采用ELISA法严格按照试剂盒说明书步骤检测， LPS采用终点显色鲎试剂法严格按照其试剂盒说明书进行。

1. 3. 4 肠道菌群qPCR绝对定量 各肠道菌引物参考相关文献使用各菌属通用16S rDNA进行设计且在NCBI BLAST验证可用， 引物序列参考文献[4]， 由华大基因公司合成引物序列及合成各细菌基因标准品。各菌标准品原液测定其DNA浓度按浓度依次10倍稀释8个梯度待用， 各样本粪便DNA提取严格按照试剂盒说明书进行， 紫外分光光度计测定DNA浓度及纯度， 再将各样本DNA稀释到相同浓度备用。qPCR绝对定量采用20 μl反应体系：样本DNA模板/标准品DNA模板1 μl， 上、下游引物各1 μl， 灭菌蒸馏水7 μl， SYBR Green SuperMix 10 μl， 稍震荡混匀且稍离心后进行荧光定量PCR程序。qPCR扩增条件为：95℃预变性5 min， 58℃15 s， 72℃30 s， 进行40个循环， 每个样本重复检测3次。数据由荧光PCR仪自带软件分析完成， 根据标准曲线计算扩增效率E在90%～105%， 且根据标准曲线线性方程得到各样本的拷贝数。endprint

1. 4 統计学方法 采用SPSS17.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验；计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 血糖血脂及炎症情况 对照组与模型组的血糖、TC、TG、HDL-C、LDL-C、体重、CRP、LPS比较差异均具有统计学意义（P<0.05）；对照组与二甲双胍组的TC、TG、HDL-C、LDL-C、体重、CRP、LPS比较差异均具有统计学意义（P<0.05）；对照组与阿托伐他汀组的血糖、TC、TG、HDL-C、LDL-C、体重、CRP比较差异均具有统计学意义（P<0.05）。二甲双胍组与阿托伐他汀组的血糖、TC、TG、HDL-C、LDL-C、LPS比较差异均具有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2. 2 肠道菌群变化 各组肠道总菌比较差异无统计学意义（P>0.05）， 表明各组肠道菌群总量一致。与对照组比较， 模型组2型糖尿病肠道菌群中肠杆菌、肠球菌增加， 乳杆菌、双歧杆菌和拟杆菌减少， 且干预后具体菌属改变主要表现为：二甲双胍组和阿托伐他汀组肠杆菌和肠球菌均减少， 乳杆菌、双歧杆菌和拟杆菌增加（P<0.05）；而二甲双胍组较阿托伐他汀组更加能提高双歧杆菌和拟杆菌的数量（P<0.05）， 阿托伐他汀组较二甲双胍组更加能减少肠杆菌、肠球菌和提高乳杆菌的数量（P<0.05）。见表2。

3 讨论

人体的肠道菌群包括了10～100万亿个微生物， 1千多种不同的菌属， 是人体所有细胞总数的10倍[5]。肠道菌群在人体的新陈代谢、营养、能量、免疫等功能方面都起着非常重要的作用， 是人体最大的器官[6]。目前研究发现很多疾病都与肠道菌群相关[6]。2型糖尿病是目前全世界最广泛的慢性代谢性疾病， 其发病率日益增长[7]。我国2型糖尿病的发病率为11.6%， 也在迅速增加[8]。Larsen 等[9]通过使用16S rDNA测序和荧光定量PCR方法发现2型糖尿病患者肠道菌群总数不发生改变， 其多样性发生改变， 主要是肠道益生菌如双歧杆菌、乳酸杆菌数量下降， 变形菌门明显增多， 刘海霞等[10]采用qPCR检测2型糖尿病患者粪便发现双歧杆菌减少， 粪肠球菌增加。作者的研究也显示2型糖尿病肠道菌群总体不变， 会出现双歧杆菌、乳杆菌的减少以及属于变形菌门的肠杆菌、肠球菌增加相一致的结果。

近年研究发现， 肥胖及相关代谢性疾病如糖尿病患者血清等都存在LPS、CRP、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）等炎症因子的升高， 慢性低度炎症反应一直伴随疾病始终[11]。LPS是肠道菌群中革兰阴性菌细胞壁成分的脂多糖， 是肠道菌群， 代谢产物， 其参与糖尿病等代谢疾病的肠道炎症反应， 且可诱导慢性系统炎症， 从而导致以及加速糖尿病等代谢性疾病发生发展[12]。Cani等[13]发现双歧杆菌可以改善高脂肪因素的2型糖尿病小鼠胰岛素抵抗情况， 且也可以降低LPS等炎症因子， 改善肠道黏膜屏障， 可见肠道菌群已成为防治糖尿病的新靶点。本研究发现主要的降糖药物二甲双胍和降脂药物阿托伐他汀均可降低糖尿病炎症因子LPS和CRP， 且阿托伐他汀的降低LPS效果更佳。

二甲双胍是临床最主要广泛的降糖药， 为糖尿病治疗的一线用药， 其可以通过抑制肝糖原异生， 增加外周组织利用葡萄糖， 抑制肠壁细胞摄取葡萄糖， 减少胰岛素抵抗， 增加胰岛素敏感性， 从而降低血糖。目前研究已显示其可以调节肠道菌群， Shin 等[14]研究发现， 高脂饮食喂养的糖尿病小鼠给予二甲双胍治疗后肠道内粘液素降解菌Akkermansia明显增多， 表明肠道菌群可能与二甲双胍降糖机制相关。Forslund等[15]研究也发现二甲双胍对2型糖尿病患者肠道菌群有影响， 主要会显著增加肠杆菌， intestinibacter属显著降低， 且不同国家2型糖尿病患者肠道菌群影响不同。本研究发现二甲双胍会减少2型糖尿病小鼠肠杆菌数量， 其可能跟种属不同相关。阿托伐他汀是他汀类降脂药的代表药物， 其具有很强的降脂作用， 却会产生血糖升高等副作用， 但是降脂也是防治糖尿病等代谢性疾病的重要环节， 且目前研究大多显示肠道菌群与脂质代谢紧密相关[16]。所以作者的研究发现阿托伐他汀可以增加益生菌乳杆菌、双歧杆菌和拟杆菌， 减少肠杆菌及肠球菌致病菌， 且其增加乳杆菌， 减少肠杆菌和肠球菌效果明显优于二甲双胍。可见阿托伐他汀在降脂的同时可能主要是通过调节增加乳杆菌多产生丁酸盐等短链脂肪酸从而抑制致病菌肠杆菌和肠球菌的生长， 减少其代谢产物LPS的产生， 最终达到降低炎症反应的作用， 从而发挥降脂作用， 改善糖尿病。

综上所述， 阿托伐他汀可以通过减少肠杆菌和肠球菌致病菌和增加乳杆菌益生菌以及减少其代谢产物LPS来调节2型糖尿病肠道菌群， 其可能是他汀降脂药作用于2型糖尿病的机制之一。且阿托伐他汀与二甲双胍在对糖尿病肠道菌群影响方面各有侧重点， 将来进一步研究两者在糖尿病肠道菌群的不同作用， 可以发挥两种药的协同作用， 更有利于防治2型糖尿病的发生发展。

参考文献

[1] Chen L， Magliano DJ， Zimmet PZ. The worldwide epidemiology of type 2 diabetes mellitus—present and future perspectives. Nature Reviews Endocrinology， 2012， 8（4）：228-236.

[2] Musso G， Gambino R， Cassader M. Obesity， Diabetes， and Gut Microbiota： The hygiene hypothesis expanded？ Diabetes Care， 2010， 33（10）：2277-2284.endprint

[3] 沈亚非， 徐焱成. 高糖高脂膳食和链脲佐菌素诱导2型糖尿病模型的建立. 中华实用诊断与治疗杂志， 2006， 20（9）：649-650.

[4] Zeng YQ， Dai Z， Lu F， et al. Emodinviacolonic irrigation modulates gut microbiota and reduces uremic toxins in rats with chronic kidney disease. Oncotarget， 2016， 7（14）：17468-17478.

[5] Burcelin R， Serino M， Chabo C， et al. Gut microbiota and diabetes： from pathogenesis to therapeutic perspective. Acta Diabetologica， 2011， 48（4）：257-273.

[6] Tremaroli V， B?ckhed F. Functional interactions between the gut microbiota and host metabolism. Nature， 2012， 489（7415）：242.

[7] Rathmann W， Giani G. Global prevalence of diabetes： estimates for the year 2000 and projections for 2030. Diabetes care， 2004， 27（10）： 2568-2569.

[8] Xu Y， Wang L， He J， et al. Prevalence and control of diabetes in Chinese adults. Jama， 2013， 310（9）：948-959.

[9] Larsen N， Vogensen FK， Berg FWJVD， et al. Gut Microbiota in Human Adults with Type 2 Diabetes Differs from Non-Diabetic Adults. Plos One， 2010， 5（2）：e9085.

[10] 刘海霞， 李晶， 刘奔， 等. 阿卡波糖对2型糖尿病患者粪便中双歧杆菌数量的影响. 中华内分泌代谢杂志， 2011， 27（11）： 928-931.

[11] Esser N， Legrandpoels S， Piette J， et al. Inflammation as a link between obesity， metabolic syndrome and type 2 diabetes. Diabetes Research & Clinical Practice， 2014， 105（2）：141.

[12] Hansen J， Rinnov A， Kroghmadsen R， et al. Plasma follistatin is elevated in patients with type 2 diabetes： relationship to hyperglycemia， hyperinsulinemia， and systemic low-grade inflammation. Diabetes/metabolism Research & Reviews， 2013， 29（6）：463-472.

[13] Cani PD， Neyrinck AM， Fava F， et al. Selective increases of bifidobacteria in gut microflora improve high-fat-diet-induced diabetes in mice through a mechanism associated with endotoxaemia. Diabetologia， 2007， 50（11）： 2374-2383.

[14] Shin NR， Lee JC， Lee HY， et al. An increase in the Akkermansia spp. population induced by metformin treatment improves glucose homeostasis in diet-induced obese mice. Gut， 2014， 63（5）：727.

[15] Forslund K， Hildebrand F， Nielsen T， et al. Disentangling type 2 diabetes and metformin treatment signatures in the human gut microbiota. Nature， 2015， 528（7581）：262-266.

[16] 饒翀， 肖新华. 肠道菌群和脂代谢异常. 中华临床医师杂志（电子版）， 2016， 10（8）：1-3.

[收稿日期：2017-04-18]endprint