木犀草素对脑胶质瘤大鼠生长、血管生成及血管NF-κB表达水平的影响

陈侠 赖满香 冯娟 来慧丽 黄金凤

基础研究

木犀草素对脑胶质瘤大鼠生长、血管生成及血管NF-κB表达水平的影响

陈侠 赖满香 冯娟 来慧丽 黄金凤

作者单位：510520 广东省广州市，广东食品药品职业学院护理学院

目的 初步探析木犀草素联合替莫唑胺对脑胶质瘤大鼠生长、血管生成及血管NF-κB表达水平的影响，为胶质瘤的防治提供新思路。方法 120只雌性Wistar大鼠进行实验。30只做体外实验确定最佳处理条件。另外90只分为3组并进行造模，分别用木犀草素、替莫唑胺、木犀草素联合替莫唑胺进行处理，比较各组细胞周期（G2/M所占比例）、血管内皮生长因子（VEGF）表达及血管NF-κB表达。结果 联合处理组的 G2/M 所占比例、VEGF、NF-κB 分别为（3.6±1.6）%、（16.2±2.5）%、（347.7±70.2）mm2，分别低于木犀草素处理组和替莫唑胺处理组，差异有统计学意义（P＜0.05）。同时木犀草素处理组的G2/M所占比例、VEGF、NF-κB也低于替莫唑胺处理组，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 木犀草素可多靶点、多环节、多途径抑制肿瘤，且可透过血脑屏障，对细胞周期、VEGF和NF-κB表达均有明显抑制作用，与替莫唑胺联合应用治疗脑胶质瘤可取得较佳效果，值得进一步展开深入研究。

木犀草素； 替莫唑胺； 缺氧诱导因子； 脑胶质瘤； NF-κB表达

脑胶质瘤为常见神经系统原发性肿瘤，世界卫生组织将其分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四个等级，其中Ⅲ、Ⅳ级为恶性胶质瘤，易局部扩散，治疗难度较大且易复发，多预后不佳，中位生存期仅为12个月左右[1]。随着近年来医学科学的发展，胶质瘤诊治水平获得较大进步。目前临床上多以手术切除为基础，结合化疗、放疗、免疫、分子靶向疗法等治疗脑胶质瘤[2,3]。有关木犀草素治疗胶质瘤的研究较为缺乏，但已有研究[4,5]证实，其有显著抗肿瘤及药物增敏作用，可透过血脑屏障，且毒副反应轻，为脑胶质瘤的治疗提供了思路。本研究拟从对脑胶质瘤细胞系U87-MG联合给药入手，首先进行体外实验，即采用时间梯度和浓度梯度的正交组合验获取最佳处理条件并计算出IC50值。于该条件下应用流式细胞术检测细胞周期、血管内皮生长因子（VEGF）和核转录因子κB（NF-κB）活性，初步探析木犀草素联合替莫唑胺对脑胶质瘤大鼠生长、血管生成及血管NF-κB表达水平的影响，从理论上证实联合用药的有效性，为胶质瘤的防治提供思路，报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 低温冰箱（Sanyo公司提供）、恒温水浴箱（Huber公司提供，型号Polystat CCL）、台式低温离心机（Deppendorf公司提供，型号Centrifuge5415）、微量加样器（Gilson公司提供）、超纯水系统（英国提供，型号Pall PL 5124L 180224）、电子分析天平（Sartorius公司提供，型号A200S）、光学显微镜（Olympus公司提供，型号BH-2）、紫外分光光度计（Shimadiu公司提供，型号UA-160A）、硫喷妥钠粉剂（协和发酵公司提供）、Trans AMTM NF-κB p65试剂盒（由美国 ActiveMotif公司提供）、Bio-Rad密度分析仪（美国伯乐公司提供，型号GS-900）；健康雌性Wistar大鼠120只，体重约为200 g，由中国医科大学实验动物中心提供；NF-κB引物由日本株式会社合成。

1.2 实验步骤

1.2.1 体外实验 用30只大鼠做正交实验设时间梯度（24 h、48 h、72 h）和浓度梯度（Lut：0 μM、10 μM、20 μM、40 μM、80 μM；TMZ：100 μM、200 μM、300 μM、400 μM、500 μM)），分别对木犀草素处理组、替莫唑胺处理组和木犀草素联合替莫唑胺处理组进行细胞存活率检测，每组30只。采取MTT法，计算IC50值，明确合适的联合用药浓度及时间组合。

1.2.2 体内实验 裸鼠成瘤。常规培养C6大鼠胶质瘤细胞，用含1.2%甲基纤维素的DMEM培养基制备C6胶质瘤细胞悬液备用，浓度为1×10个/10 μl。用 10%水合氯醛（3.5 ml/kg，ip）麻醉大鼠，固定于脑立体定位仪上。用微量注射器将C6胶质瘤细胞悬液注入大鼠右侧大脑基底核（前囟前1 mm，矢状缝旁3 mm，深4.5 mm）。肿瘤移植2周后，用48 h IC50值浓度组合对细胞进行处理，采用流式细胞术检测细胞凋亡、细胞周期和VEGF表达。应用电子显微镜及吖啶橙染色荧光显微镜观察细胞自噬泡，检测联合用药处理后细胞的自噬情况。观察VEGF表达：于肿瘤细胞浆中，在阳性细胞密集区域计数1000个细胞，计算阳性细胞数占全部肿瘤细胞数的百分率。

1.2.3 NF-κB活性检测 将三组实验大鼠处死，采用15%葡聚糖梯度离心法对脑胶质瘤微血管内皮细胞核蛋白及肿瘤组织的微血管段进行提取，按照标准程序进行C6细胞的总RNA提取和RT反应。于聚合酶链反应专用试管中加入NF-κB引物，之后依次加入c-DNA样本、上游与下游引物各1 μl、PCR专用 distilled H2O 6 μl，进行扩增反应。循环程序：95 ℃ 15 min、95 ℃ 20 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 90 s，共24个循环，之后于72℃下延伸10 min。对PCR反应产物进行染色，加4%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳（50 mA，10 V/cm），室温下泳动 45 min。用紫外线摄像，使用Bio-Rad密度分析仪行半定量分析。

1.2.4 NF-κB的免疫组化检测 制备各组脑胶质瘤大鼠的脑组织切片，厚度为12μm。切片用SP法行免疫组织化学染色，首先用10%正常山羊血清封闭切片，之后用小鼠抗大鼠p65多克隆抗体1∶150稀释，于4℃下孵育过夜，洗去一抗，滴加用生物素标记的二抗（羊抗小鼠IgG）及辣根酶标记链酶卵白素工作液，使用增敏二氨基联苯胺进行显色，苏木素复染。应用Motic Images Advanced 3.2图像分析系统对图片进行采集及定量分析。

1.3 统计学方法 采用统计学软件SPSS 19.0处理研究数据。计量资料用±s表示，t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞周期、VEGF和NF-κB比较 联合处理组的G2/M所占比例、VEGF、NF-κB密度值分别为（3.6±1.6）%、（16.2±2.5）%、（347.7±70.2）mm2，均低于木犀草素处理组和替莫唑胺处理组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表 1。

2.2 大鼠胶质瘤微血管的NF-κB分布和表达NF-B（p65）的阳性反应物呈棕褐色颗粒状，以胶质瘤细胞及肿瘤微血管内皮细胞的表达较为明显。与经替莫唑胺处理组相比，经木犀草素与替莫唑胺联合处理后的NF-κB（p65）在肿瘤微血管内皮细胞上的表达明显减弱。见图1。

表1 各组细胞周期、VEGF和NF-κB的比较（±s）

表1 各组细胞周期、VEGF和NF-κB的比较（±s）

注：VEGF：血管内皮生长因子；NF-κB：核转录因子kappa B。与木犀草素处理组比较，aP＜0.05；与替莫唑胺处理组比较，bP＜0.05

组别 例数细胞周期（G2/M所占比例）（%）VEGF（%）NF-κB（mm2）木犀草素处理组 30 5.2±2.1 26.7±6.1 440.3±56.4替莫唑胺处理组 30 13.4±3.5a 41.6±8.3a 533.9±66.8a联合处理组 30 3.6±1.6ab 16.2±2.5ab 347.7±70.2ab

3 讨论

脑胶质瘤为恶性肿瘤，手术及放疗后的中位生存期仅为1年左右，且术后易复发。药物治疗神经胶质细胞瘤的效果相对较差，原因在于药物较难通过血脑屏障[6,7]，且胶质瘤本身对化疗易产生耐药性，如替莫唑胺（TMZ）。即便如此，药物治疗对胶质细胞瘤临床治疗的重要性依然无法被完全否定。延长患者中位生存期的临床意义因而更为重大。

TMZ是一种烷基化试剂，为神经胶质瘤的重要治疗药物之一。与传统烷化剂相比，其对脑胶质瘤的治疗可有效延长恶性胶质瘤患者的无进展存活时间，客观缓解率高，耐受情况更佳[8-10]。对于新诊断的胶质瘤，TMZ可增强肿瘤细胞对放射治疗的敏感度，但也会产生相加的细胞毒作用。由于其存在耐药问题且难以透过血脑屏障，因而往往只能作为辅助疗法[11]。较多研究[12-14]均证实，替莫唑胺对脑胶质瘤的治疗有效，但其存在毒副作用和耐药性的缺点。基于此，探索新的治疗方案以提高脑胶质瘤化疗效果具有重要意义。

本研究用大鼠进行动物实验，结果显示，经正交实验设时间梯度及浓度梯度处理获取到最佳联合用药浓度及时间组合后，各组在48 h IC50值浓度组合下，细胞周期、VEGF及NF-κB活性均存在显著差异，具体体现为联合处理组的大鼠脑细胞G2/M所占比例、VEGF及NF-κB活性均低于木犀草素处理组和替莫唑胺处理组；而木犀草素处理组的大鼠脑细胞G2/M所占比例、VEGF及NF-κB活性也低于替莫唑胺处理组，提示木犀草素在抑制大鼠生长、血管形成及血管NF-κB表达方面具有显著作用。细胞周期和VEGF均与肿瘤细胞的生长有直接关系，其中G2/M所占比例越高，细胞增值能力越强[15]。血管生成主要影响实体肿瘤的生长与转移，无血管生成状态下，肿瘤直径一般＜1 mm[16]。有动物实验[17]显示，VEGF对血管生成的诱导能力在肿瘤早期即有所表现，为肿瘤固有生物属性。NF-κB是一类核转录调节蛋白，具有多向性的特点，一般情况下在细胞浆中处于低活性状态[18]，在二聚体形成、DNA结合、核定位等方面发挥重要作用。NF-κB在神经系统中广泛存在，病毒、细胞因子、信号分子、氧化应激等因素均可能激活NF-κB。当发生失血、感染、缺血-再灌注时，NF-κB活性就会增大。而不少研究[19,20]均认为，NF-κB活性的增大为引起多器官功能衰竭的关键环节，可能增加诱导急性炎症反应综合征的风险。

近年来大量临床研究[21,22]也显示，木犀草素对乳腺癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌等癌症有显著作用，与本研究结果一致。木犀草素（Lut）是一种天然黄酮，具有一定代表性，主要存在于金银花、荆芥、菊花等药物中，弱酸性，微溶于水，在碱溶液中溶解度高，具有多种显著生物活性。有文献报道[23]，木犀草素可抗增殖、诱导癌细胞凋亡、凋亡增敏、抑制血管生成，并发挥化学预防作用。也有研究[24]发现，木犀草素可通过干扰糖原合成酶激酶、细胞周期蛋白D1的表达等途径抑制结肠癌细胞的增殖。国外专家[25]用流式细胞术检测细胞周期发现，木犀草素浓度越高，周期蛋白cyclin A、p-Rb、p-CDC2的表达抑制程度越大，还可将A549阻滞于G2期，最终抑制血管生成及肿瘤细胞生长。

综上所述，木犀草素可提高放化疗敏感度，诱导肿瘤细胞凋亡，协同抑制肿瘤生长，多靶点、多环节、多途径抑制肿瘤，且可透过血脑屏障，有效抑制VEGF和NF-κB表达，在脑胶质瘤临床治疗中有较大潜力。

图1 A为经木犀草素与替莫唑胺联合处理后的大鼠胶质瘤微血管的NF-κB分布与表达B为经替莫唑胺处理的大鼠胶质瘤微血管的NF-κB分布与表达

［1］王洪燕，全康，蒋燕灵，等.木犀草素抗肿瘤细胞增殖及增敏抗肿瘤药物作用研究.浙江大学学报，2010，39：30-36.

［2］Yuan Y，Xue X，Guo RB，et al.Resveratrol Enhances the Antitumor Effects of Temozolomide in Glioblastoma via ROS-dependent AMPK-TSC-mTOR Signaling Pathway.CNSNeuroscience&Therapeutics，2012，18：536-546.

［3］沈冬，仇志坤，陈银生，等.干扰素 α/β体外增敏替莫唑胺对MGMT阳性胶质瘤干细胞作用.中山大学学报（医学版），2012，33：368-372.

［4］Lin Y，Shi X，Wang X，et al.Luteolin，a flavonoid with potentials for cancer prevention and therapy.Curr Cancer Drug Targets，2008，8：634-646.

［5］朱颂华，陆泳宇.替莫唑胺与司莫司汀对胶质母细胞瘤的临床疗效比较.河南医学研究，2015，24：18-20.

［6］Kanzawa T，Germano IM，Komata T，et al.Role of autophagy in temozolomide-induced cytotoxicity for malignant glioma cells.Cell Death Differ，2004，11：448-457.

［7］王海兰，詹正宇，冯苗.贝伐单抗治疗高级别脑胶质瘤的研究进展.中国肿瘤临床，2013，40：1001-1003.

［8］Chalmers AJ，Ruff EM，Martindale C，et al.Cytotoxic effects of temozolomide and radiation are additive-and schedule-dependent.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2009，75：1511-1519.

［9］Ostrom QT，Gittleman H，Liao P，et al.CBTRUS statistical report：primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011.Neuro-Oncology，2014，16：62-63.

［10］Mannas JP，Lightner DD，Defrates SR，et al.Long-term treatment with temozolomide in malignant glioma. Clin Neurosci，2014，21：121-123.

［11］李晓兴，王之敏.替莫唑胺治疗神经胶质瘤的研究进展.实用医学杂志，2012，8：27-30.

［12］Mannas JP，Lightner DD，Defrates SR，et al.Long-term treatment with temozolomide in malignant glioma. Clin Neurosci，2014，21：121-123.

［13］De Groot M，Douw L，Sizoo EM，et al.Levetiracetam improves verbal memory in high-grade glioma patients.Neuro-Oncology，2013，15：216-223.

［14］Nagane M.Dose-dense temozolomide：Is it still promising?Neurol Med Chir（Tokyo），2015，55：38-49.

［15］Eyal S，Hsiao P，Unadkat JD.Drug interactions at the blood brain barrier： Factor fantasy? Pharmacology＆Therapeutics，2009，123：:80-104.

［16］张芳芳，沈汉明，朱心强.木犀草素抗肿瘤作用的研究进展.浙江大学学报（医学版），2006，35：573-577.

［17］Edward GS，Meihua W，Stephen WC，et al.Randomized trial of radiation therapy plus procarbazin，lomustine，and vincristine chemotherapy for supratentorial adult low-grade glioma：Initial results of RTOG 9802.Clin Oncol，2012，30：3065-3070.

［18］Pandurangan AK，Dharmalingam P，Anandasadagopan S，et al．Effectofluteolin on the levels ofglycoproteins during azoxymethane-induced colon carcinogenesis in mice.Asian Pac J Cancer Prev，2012，13：1569-1573.

［19］Kim HY，Jung SK，Byun S，et al．Raf and PI3K are the molecular targets for the anti-metastatic effect of luteolin.Phytother Res，2013，27：1481-1488．

［20］戴宜武，王振光，秦家振.脑胶质瘤治疗进展.中华临床医师杂志，2013，7：6225-6228.

［21］Cai X，Lu W，Ye T，et al.The molecular mechanism of luteolin-induced apoptosis is potentially related to inhibition of angiogenesis in human pancreatic carcinoma cells.Oncol Rep，2012，28：1353-1361.

［22］Chiang CT，Way TD，Lin JK.Sensitizing HER2-overexpressing cancer cells to luteolin-induced apoptosis through suppressing p21（WAF1/CLP1）expression with rapamycin.Molecular Cancer Therapeutics，2007，6：2127-2138.

［23］Ju W，Wang X，Shi H，et al.A critical role of luteolininduced reactive oxygen species in blockage of tumor necrosis factor-activated nuclear factor-kappa B pathway and sensitization ofapoptosisin lung cancercells.Molecular Pharmacology，2007，71：1381-1388.

［24］胡春萍，蔡雪婷，胡婷婷，等.木犀草素诱导非小细胞肺癌细胞株 A549凋亡和 G2周期阻滞.中国中药杂志，2012，37：1259-1263.

［25］Jeon YW，Suh YJ.Synergistic apoptotic effect of celecoxib and luteolin on breast cancer cells.Oncol Rep，2013，29：819-825.

The effects of luteolin on growth,angiogenesis and expression level of vascular NF-κB in rats with brain gliomas

CHEN Xia，LAI Man-xiang，FENG Juan，et al.College of Nursing，Guangdong Food and Drug Vocational College，Guangzhou 510520，China

ObjectiveTo preliminarily explore the effects of luteolin combined with Temozolomide on growth，angiogenesis and expression level of vascular NF-κB in rats with brain gliomas and provide new ideas for the prevention and treatment of gliomas.Methods120 female Wistar rats were used for experiment.The optimal treatment conditions were determined by 30 rats in vitro experiment.Another 90 rats were divided into three groups and were used for modeling.The three groups were treated with luteolin，Temozolomide and luteolin combined with Temozolomide，respectively.The cell cycle（proportion of G2/M），expression of vascular endothelial growth factor（VEGF）and expression of vascular NF-κB were compared.ResultsIn the combined treatment group，the proportion of G2/M，VEGF and NF-κB［（3.6±1.6）%，（16.2±2.5）%，（347.7±70.2）mm2］were lower than those in luteolin treatment group and Temozolomide treatment group respectively（P＜0.05）.Besides，the proportion of G2/M，VEGF and NF-κB in luteolin treatment group were lower than those in Temozolomide treatment group（P＜0.05）.ConclusionLuteolin can inhibit tumor through multi-target，multi-link and multiple ways.Besides，it can also significantly inhibit cell cycle，expression of VEGF and NF-κB through blood brain barrier.Its combination with Temozolomide in the treatment of glioma can achieve a better effect，which is worthy of further study.

Luteolin； Temozolomide； Hypoxia inducible factor； Glioma； Expression of NF-κB

10．3969/j．issn．1672－5301．2017．02．025

Q95-33；R739.41

A

1672-5301（2017）02-0186-04

2016-07-14）