中药天龙发酵前后与酶解提取物抗肿瘤效果比较研究

朱明珠，王 颖，邢佰颖，刘春雨，刘双双，王集会，刘玉红，闫 滨

(1.山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355；2.山东中医药大学 实验中心，山东 济南 250355；3.山东中医药大学 中医学院，山东 济南 250355 )

中药天龙发酵前后与酶解提取物抗肿瘤效果比较研究

朱明珠1，王 颖1，邢佰颖1，刘春雨1，刘双双1，王集会2，刘玉红1，闫 滨3*

(1.山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355；2.山东中医药大学 实验中心，山东 济南 250355；3.山东中医药大学 中医学院，山东 济南 250355 )

目的:比较不同方法处理的天龙水提物对乳腺癌MCF-7细胞株的抑制作用。方法:使用酶解法和甲基噻唑蓝(MTT)法，以蛋白质水解度、对乳腺癌细胞MCF-7的抑制率为指标，评价混合酶对发酵前后天龙粉的水解效果，以天龙粉水提物作为对照组，比较天龙粉酵解物和发酵前、后分别经胰蛋白酶和弹性蛋白酶混合酶解水提物对乳腺癌细胞的抑制作用。结果:混合酶对天龙粉的水解度(52.46%)大于对发酵天龙粉的水解度(10.71%)；天龙粉混合酶解水提物对乳腺癌细胞的抑制率为正值，随浓度成正相关，天龙粉与发酵天龙粉酶前、酶后水提物对乳腺癌细胞的抑制率为负值。结论 ：天龙粉混合酶解水提物对乳腺癌MCF-7细胞起到抑制作用，天龙粉与发酵天龙粉酶前、酶后水提物对乳腺癌细胞无抑制作用。

天龙；混合酶解；酵解；MTT法；抗肿瘤

中药天龙又名壁虎，为壁虎科动物无蹼壁虎或多疣壁虎的干燥全体，性寒，有小毒，具有止咳平喘、解毒散结、祛风定惊、通络止痛等功效[1]。大量临床研究发现，天龙对多种恶性肿瘤都具有一定抑制作用，包括肝癌、食道癌、胃癌、肺癌、甲状腺癌等[2]。天龙含有蛋白质、多糖、组织胺类、脂肪酸、核苷等多种化学成分[3]，天龙体内的抗肿瘤活性成分及药理作用机制的研究一直是天龙研究的热点。研究表明，天龙抗肿瘤的药理机制可能与诱导肿瘤细胞凋亡和分化，抑制肿瘤新生血管生成，增强细胞免疫活性等相关，但是其抗肿瘤活性成分依然不明确。

本实验以天龙冻干粉为底物，使用白僵菌孢子粉进行发酵，并分别将天龙粉与发酵天龙粉用胰蛋白酶、弹性蛋白酶2种蛋白酶进行混合水解。分为天龙组、发酵天龙组、天龙酶组、发酵天龙酶组共四组，以天龙组作为对照组，同时以对乳腺癌细胞(MCF-7)的抑制率为指标，比较发酵、混合酶法、以及发酵混合酶解法处理后天龙抗肿瘤效果。

1 实验材料

1.1 药材

天龙购自安徽亳州，经山东中医药大学生药系高德民老师鉴定为无蹼壁虎 Gekko swinhonis Gunther。天龙粉，批号: 20150501; 发酵天龙粉，批号: 20150801;以上天龙粉均由山东中医药大学实验中心化学实验室自制。白僵菌孢子粉( 100亿/g，山东省农业科学院植物保护研究所自筛菌株-桃5)。

1.2 主要仪器

FA-1004N型电子分析天平(上海精密仪器有限公司)；766-2型远红外辐射干燥箱；HWLC型电热恒温水温箱(北京医疗设备厂)；立式压力蒸汽灭菌锅(LDZX-50FBS)；LDZ4-0.8 型离心机( 北京医用离心机厂) ；EL340i型全自动酶标仪(Melecular Devices)；倒置显微镜(XDS-1B)；PHS-25型pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)等。

1.3 试剂

胰蛋白酶(国药集团化学试剂有限公司);弹性蛋白酶(上海源叶生物科技有限公司);蒸馏水;注射用顺铂(齐鲁制有限公司)等。

1.4 实验细胞

乳腺癌MCF-7细胞株由山东省立医院提供。

2 实验方法

2.1 发酵天龙粉的制备

精密称取一定量天龙干粉，加入活的白僵菌孢子粉，孢子粉加少量吐温-80，用适量灭菌水将其稀释成含1×108 个孢子的混悬液，取适量，拌匀润湿，在25～28 ℃,湿度95 %恒温恒湿培养箱中发酵8 d左右，待长满菌丝后停止发酵。

2.2 水溶性活性物质超声提取

分别精密称取发酵与未发酵的天龙粉各两份，每份2.0000g，按照料液比1:30加入定量蒸馏水，超声提取30min，抽滤、离心，定容100 mL。

2.3 混合酶酶解法

取2.2中发酵与未发酵的天龙水提液，分别置于150 mL锥形瓶中，各加入一定量氢氧化钠溶液调pH值=8，加入胰蛋白酶0.08 g，弹性蛋白酶0.1334 g，置37 ℃电热恒温水温箱中酶解4 h，酶解期间，用搅拌装置匀速不断搅拌，保证酶与原料充分接触反应，将酶解液分别抽滤、离心，定容至250 mL的容量瓶中，得酶解液，2种蛋白酶的水解条件见表1。

表1 2种蛋白酶的水解条件

2.4 氨基肽氮含量测定

2.4.1 显色剂茚三酮的配制

精确称取果糖0.3 g，茚三酮0.5 g,磷酸二氢钾6 g，磷酸氢二纳10 g，加水定容至100 mL。

2.4.2 绘制标准曲线

精密称取0.1000 g干燥后的甘氨酸，溶解定容至100 mL，取2 mL定容至100 mL为20 μg/mL的溶液，分别取0，1,2,3,4,5 mL定容至10 mL,配成浓度为0,2,4,6,8,10 μg/mL的标准溶液，分别取2 mL稀释液于试管中，加入1mL茚三酮，沸水浴加热15min，冷水冷却，加入5.00 mL的40 %乙醇溶液摇匀，放置15min，570 nm测定吸光度，进行标准曲线的绘制。

2.4.3 测定样品含量

取4中天龙粉的水解液稀释到适宜浓度，按照“2.4.2”的方法测定样品的吸光度，代入标准曲线求得-NH2的含量，由稀释倍数得出水解液氨基肽氮的含量。

2.5 测定原料总氮量

凯氏定氮法[4]测定原料中总氮量。

2.6 测定水解度

水解度为蛋白质水解过程中被裂解的肽键数与蛋白质总肽键数的比值。由“2.4”方法测得水解液游离氨基肽氮的含量和“2.5”测得原料总氮量，从而计算水解度，公式如下：

A:原料中总氮量 B:水解液中氨基肽氮量 C:原料中游离的氨基肽氮量

2.7 MTT分析法[5]

2.7.1 细胞复苏

将冻存的肿瘤细胞从超低温冰箱取出，将其立即投入预先加热到37 ℃的灭菌水中，待冻存的液体溶化后，进行2000 r/min离心3 min，收集溶化后的细胞，用含10 %胎牛血清1640的新鲜培养基在5 %CO2、37 ℃培养箱中进行细胞培养。

2.7.2 接种

等肿瘤细胞长至80 %融合时，用0.25 %的胰酶细胞消化液(含0.02 %EDTA)对其消化，将处于对数生长期的肿瘤细胞以100 μL/孔进行接种，分别接种于96孔板中，预先留下三个调零孔，在调零孔只加不含血清的1640培养基，不加肿瘤细胞。

2.7.3 加药

称取10mg冻干粉，溶于10 mL1640培养液，配成含有效分2 mg/mL的初始浓度，无菌环境中用0.22 μm滤膜过滤，用已经虑菌的1640培养液依次稀释，配成2、1、0.5、0.25、0.125 mg/mL药物浓度梯度，待96孔板中细胞长满单层后，弃去培养基，调零组、空白对照组各加入100 μL不含血清的1640培养基，阳性对照组加100 μg/mL的顺铂100 μL，其他给药组每孔分别加入含不同浓度筛选药物的1640培养基100 μL，每个浓度的药物重复加加5个孔。以天龙粉水提液组为对照，将细胞在37 ℃、5 %CO2培养箱中继续培养24 h。

2.7.4 MTT 法测定细胞抑制率

每孔各加入5 mg/ml MTT溶液20 μL,培养箱内避光反应4个小时,吸去上清液，加入100 μLDMSO，用酶标仪于492 nm测OD值,按如下公式计算细胞抑制率。

3 结果

3.1 氨基肽氮含量测定

3.1.1 标准曲线测定

C=3.4792A+0.0267(μg/mL) R2=0.9983

C:氨基肽氮浓度 A:吸光度

3.1.2 氨基肽氮含量

水解液中氨基肽氮含量见表2。

表2 水解液中氨基肽氮含量

3.2 样品水解度测定

凯氏定氮法测得1.0000g天龙发酵前、后总氮量分别为13.1841mg/g，28.1187mg/g。由公式计算水解度,见表3。

表3 样品水解度

3.3 MTT法测定样品对乳腺癌细胞MCF-7的抑制率

天龙水提液、发酵天龙酶前、后水提液对乳腺癌细胞无抑制作用，天龙混合酶解液对乳腺癌细胞具有抑制作用，且抑制率曲线随酶解液浓度呈正相关，见图1。

图1 不同浓度天龙混合酶解液对乳腺癌MCF-7的抑制率曲线

4 讨论

研究表明，蛋白质、多糖、核酸是动物药中的水溶性活性成分。生物技术的快速发展，使酶法和酵法逐渐被广大医学工作者所重视，被广泛应用于中药研究领域。酶法在中药提取中的应用研究始于20世纪90年代中期，广泛应用于多种中药活性成分的提取研究中，并取得了较好的效果，某些动物药经酶解后释放出活性多肽和其它活性小分子物质[6]，表现出较原药更强的生物活性。酶具有专一性，弹性蛋白酶只专一水解丙氨酸、甘氨酸及短脂肪链氨基酸的羧基形成的肽键，胰蛋白酶只专一水解赖氨酸、精氨酸羧基形成的肽键，弹性蛋白酶和胰蛋白酶最适pH值在8.0左右,弱碱性条件利于中和蛋白质水解过程断裂的羧基，利于水解和活性小分子释放，更好的发挥药理活性[7]。发酵过程中，微生物可将中药中糖类、蛋白质等成分进行分解转化，生成一些具有活性的小分子水溶性物质，同时将中药的细胞壁进行破损，使细胞里水溶性成分溶出[8]，进而发挥药理作用。

本实验混合酶对天龙粉的水解度高于对发酵天龙粉的水解度，水解度越高，越有利于小分子释放，发挥药理活性。发酵天龙粉酶前、后对乳腺癌细胞无抑制作用，且水解度低，可能与发酵过程中白僵菌将药物细胞壁破坏和白僵菌对天龙粉进行双向固体发酵中，天龙中蛋白质等成分与白僵菌的生长、代谢存在相互作用等有关。实验采用胰蛋白酶和弹性蛋白酶混合酶解，可将多种肽键进行水解，使水解度提高，生成更小分子活性物质，对乳腺癌细胞(MCF-7)的生长起抑制作用。

[1] 刘玉军,李刚,马 睿,等. 天龙抗肿瘤研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2011(07):262-264.

[2] 侯新楠. 壁虎抗肿瘤研究[D]. 北京:北京中医药大学,2008.

[3] 李 雯,王国才,张晓琦,等. 中药壁虎化学成分研究[J].中国中药杂志,2010,35(18):2412-2415.

[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：中国医药科技出版社,2015.

[5] 张金红,耿朝晖,段江燕,等. MTT比色分析法在贴壁生长细胞药物敏感性测定中的应用[J]. 南开大学学报(自然科学版),1996(04):109-112.

[6] 王爱华,柳美玲,戴志明,等.小肽的吸收机制与营养价值研究进展[J].江西饲料 , 2007(5):10-14.

[7] 焦方文,王集会,邹 龑,等. 全蝎粉酶解工艺最佳用酶的初步筛选[J].时珍国医国药,2015(10):2407-2408.

[8] 王延年,董雪,乔延江,等. 中药发酵研究进展[J].世界科学技术(中医药现代化),2010(03):437-441.

(本文文献格式：朱明珠，王 颖，邢佰颖，等.中药天龙发酵前后与酶解提取物抗肿瘤效果比较研究[J].山东化工，2017，46(06)：20-22.)

Comparative Study on Anti-tumor Effect of Chinese Herbal Medicine Tianlong Before and after Fermentation and Enzymatic Extract

ZhuMingzhu1,WangYing1,XingBaiying1,LiuChunyu1,LiuShuangshuang1,WangJihui2,LiuYuhong1,YanBin3*

(1. The Pharmacy College , Shandong Univerity of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250355,China;2.The Experiment Center ,Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355,China;3.The College of Traditional Chinese Medicine ,Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250355,China)

Objective To compare the different treatment methods of Tianlong water extract of inhibition effect on human breast cancer cell line MCF-7：Methods： Using enzyme hydrolysis method and methyl thiazolyl blue (MTT) method, the degree of protein hydrolysis and the inhibition rate on MCF-7 breast cancer cells as evaluating indicator,Evaluating the hydrolysis effect of mixed enzyme on the Tianlong powder before and after fermentation, Tianlong water extract as contrast group, comparing the inhibitory effect of water extract of Tianlong glycolysis and fermentation before and after are enzymatic hydrolysised by trypsin and elastase respectively on human breast cancer cells.Results:The hydrolysis degree(52.46%) of Tianlong on mixed enzyme hydrolysis is higher than the hydrolysis degree (10.71%) of fermentation Tianlong on it; Tianlong mixed enzymolysis water extract's inhibition rate on breast cancer cells is positive, with the positive correlation of concentration, Tianlong and fermentation Tianlong is enzymed before and after have negative inhibiting rate on breast cancer cells.Conclusion:Tianlong mixed enzymolysis water extract have inhibition on breast cancer cell MCF-7, Tianlong and fermentation Tianlong is enzymed before and after haven't inhibitory effect on breast cancer cells.

tianlong;mixed enzymatic hydrolysis;glycolysis;MTT method; antitumor

2017-02-18

山东中医药大学大学生研究训练(SRT)计划资助项目(项目编号2016031)

朱明珠(1996—)，女，山东曲阜人，本科在读，研究方向：制药工程；通信作者：闫 滨，副教授，研究方向：从事中药的活性成分的研究。

R284.1

A

1008-021X(2017)06-0020-03