甘氨酸-水杨醛席夫碱和邻菲咯啉混合配体的铜(Ⅱ)配合物与蛋白质相互作用的光谱学研究

江 阳

(1.武汉大学 化学与分子科学学院，湖北 武汉 430072;2.武汉东湖学院 生命科学与化学学院，湖北 武汉 430212)

甘氨酸-水杨醛席夫碱和邻菲咯啉混合配体的铜(Ⅱ)配合物与蛋白质相互作用的光谱学研究

江 阳1,2

(1.武汉大学 化学与分子科学学院，湖北 武汉 430072;2.武汉东湖学院 生命科学与化学学院，湖北 武汉 430212)

在模拟人体生理条件下，综合利用荧光光谱、紫外吸收光谱、圆二色谱等方法研究了抗肿瘤药物甘氨酸-水杨醛席夫碱和邻菲咯啉混合配体的铜(Ⅱ)配合物与蛋白质相互作用。荧光光谱和紫外吸收光谱的分析表明铜(Ⅱ)配合物能有效猝灭BSA的内源荧光。猝灭过程同时表现出动态猝灭特征和静态猝灭特征，猝灭机制为混合机制。圆二色谱结果表明随着铜配物的加入，能引起BSA的构象发生改变，其α-螺旋含量有所减少，肽链结构有所伸展。

血清白蛋白；生物活性小分子；光谱学方法； 抗肿瘤

将具有生物活性的配体与金属进行配合得到金属配合物，是新型抗肿瘤药物的重要类型[1-8]。 甘氨酸-水杨醛席夫碱和邻菲咯啉混合配体的铜(Ⅱ)配合物(分子结构如图1，分子式为(C26H26N3O5Cu)4，分子量为2094)是新合成的具有抗肿瘤活性的药物。X-单晶衍射数据显示这个晶体属于单斜晶系，空间群为C2/c。晶体数据为a=24.100(13) Å,b=13.778(7)Å,c=14.964(8)Å,=90° ,β=106.304(8)°, λ=90,V=4769(4) A3, Z=8, Dc=1.412 mg·m3, R1=0.0760, ωR2=0.1864，可观察到的衍射点为1900(I>2σ (I))。对细胞毒性实验显示铜配合物对细胞毒性的影响为10-5M。紫外可见光谱显示当加入DNA后，发生减色效应。随着配合物浓度的增加，在CD图中，配合物-DNA的吸收度也在逐渐增大。加入配合物后，EB-DNA体系的荧光强度降低。配合物使DNA的粘度增加。在配合物的循环伏安中，加入DNA，峰电流降低。在配合物与pBR322 质粒DNA电泳实验中，配合物能将超螺旋切割为线形和缺刻型。

图1 抗肿瘤药物分子结构

血清白蛋白是血浆中含量最丰富的载体蛋白，药物进入体内后，要通过血浆的贮存与运输，到达受体部位，进而发生药理作用[9-11]。考虑到抗肿瘤药物的活性与重要的医疗价值，研究其与血清白蛋白的相互作用显得非常有意义，这有助于在分子水平上认识抗肿瘤药物与蛋白质的作用机理和规律，了解蛋白质结构与功能的关系，为生命科学研究提供有用的信息和数据，而且有助于认识药物作用的药效和药理，为药物分子的设计、修饰与筛选提供有益的启发与指导。本章将主要利用荧光光谱、紫外光谱和圆二色谱等光谱学方法，研究在近似生理条件下抗肿瘤药物铜配物与血清白蛋白的相互作用，从分子水平探讨其作用机理。此外，利用紫外光谱和圆二色谱考察药物对血清白蛋白二级结构的影响。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

带恒温系统的F-2500荧光光度计(日本日立公司)。TU-1901紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)；Jasco J-810 圆二色光谱仪(日本Jasco公司)。

人血清白蛋白(Human Serum Albumin, HSA),牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)等均为Sigma公司产品；NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4等均为分析纯；实验用水为三次亚沸水；HSA, BSA等溶液均为pH值=7.4的PBS缓冲溶液配成。

1.2 实验方法

溶液配制： 配制常温下pH值=7.4的PBS缓冲溶液，并由相应缓冲液配制HSA和 BSA溶液。

荧光光谱：测定该研究体系溶液在不同温度的荧光发射谱，选定激发和发射狭缝分别为2.5nm和5.0nm，以λex=280nm，绘制研究体系的荧光光谱。

吸收光谱：测定各溶液的吸收光谱及与血清白蛋白物质的量之比为1:1的药物溶液的吸收光谱。

圆二色谱：测定室温下各不同体系溶液的远紫外(200～260nm)圆二色谱。

2 结果与讨论

2.1 铜配物与BSA相互作用的荧光光谱特征

利用BSA分子中色氨酸残基的内源荧光，以λex=280nm为激发波长，在340nm附近得到很强的荧光峰；而以同样激发波长激发铜配物时，在340nm附近则没有荧光峰，表明该铜配物不会产生与BSA相互干扰的荧光。因此确定测试条件为：激发和发射狭缝宽分别为2.5nm和5.0nm；激发波长为280nm；pH值=7.4的PBS为缓冲液。固定BSA的浓度为2.0×10-6mol·L-1，逐步增加铜配物浓度, 测定其荧光光谱，得到的荧光光谱图如2所示。

a到k药物与BSA的相对浓度比为

由图2可知，随着体系中铜配物浓度的增加，BSA的内源荧光产生有规律的猝灭，荧光强度降低。但并未伴随最大发射波长的红移或蓝移，表明BSA与铜配物的作用未使其发色团的环境发生变化。

2.2 铜配物与BSA相互作用的猝灭机制

荧光猝灭过程分为动态猝灭、静态猝灭以及混合猝灭过程，其过程均遵循Stern-Volmer方程[12-13]：

F0/F=(1+KD[Q])(1+KS[Q])

(1)

式(1)中F0和F分别表示不存在和存在猝灭剂时荧光物质的荧光强度；[Q]为猝灭剂的浓度；KD与KS分别是动态与静态猝灭常数。一般情况下，猝灭过程的某一部分是可以忽略的，式(1)即简化为典型的Stern-Volmer方程：

F0/F=1+KSV[Q]

(2)

然而在有些情况下，荧光体不仅能与猝灭剂发生动态猝灭，而且能与同一猝灭剂发生静态猝灭，即同时发生动态和静态的混合猝灭现象，这种情况下实验所获得的Stern-Volmer图不是一条直线，而是一条弯向Y轴的上升曲线[14]。对于本体系所测得的荧光光谱采用典型的Stern-Volmer方程(式2)进行作图，可得Stern-Volmer关系图，如图3所示。

图3 铜配物与BSA作用的Stern-Volmer关系图

从图3中，可以看出随着铜配物浓度的升高，其Stern-Volmer图不是一条直线，而是一条明显弯向Y轴的上升曲线。说明该体系的猝灭机制很有可能是混合猝灭过程。

为了进一步探讨铜配物与BSA间的荧光猝灭作用机制，设计了不同温度(T=298，304，310K)下铜配物与BSA的作用，并利用式1对低浓度时进行线性拟合，如图4所示，所对应的猝灭常数列于表1中。

图4 不同温度下铜配物与BSA作用的Stern-Volmer关系图

pH值T/K10-5Ksv/(L·moL-1)RaS.D.bEa/(kJ·moL-1)2983.3300.99190.04467.43043.5650.99060.05148.6113103.8100.99180.0514

aR is the correlation coefficient;bS.D. is standard deviation.

表1数据显示，随着温度的升高，BSA与铜配物作用的荧光猝灭常数呈规律性增大，表明铜配物对BSA的猝灭具有动态猝灭机制的特征。

为了更进一步研究铜配物对BSA的作用机制，在T=298K，pH值=7.4时，对BSA与铜配物的紫外吸收光谱进行了测定，结果见图5。

图5为，2.0×10-6mol·L-1的铜配物的紫外吸收(曲线a)、2.0×10-6mol·L-1的BSA溶液的紫外吸收(曲线b)以及铜配物与BSA的物质的量之比为1:1的混合物与铜配物的紫外吸收差谱(曲线c)。从图5可以看出，b、c两曲线在波长为250～280nm附近出现了较明显的变化，表明该铜配物能与BSA基态分子发生相互作用，即形成一定的复合物，体现有静态猝灭的特征。

(a) curve a is the absorption spectra of the drug; (b) curve b is the absorption spectra of BSA; (c) curve c is the absorption spectra of the BSA:drug=1:1 subtracts the drug of the same concentration

图5 铜配物对BSA紫外吸收光谱的影响(T=298K)

综合以上实验结果及分析，可以推测铜配合物对BSA的猝灭机制是比较复杂的混合猝灭机制。

2.3 铜配物与BSA相互作用的表观结合常数与结合位点数

根据小分子与大分子配位方程，以lg[(F0-F)/F]对lg[Q]作图，依直线斜率和截距即可求出铜配物与BSA表观结合常数Kb及结合位点数n，表2不同温度梯度下，计算得到了铜配物与BSA相互作用的表观常数与结合位点数。

表2 不同温度下铜配物与BSA作用的表观结合常数及结合位点数

aRis the correlation coefficient;bS.D. is standard deviation.

2.4 铜配物对BSA二级结构的影响

为了考察铜配物对BSA二级结构的影响，实验设计并测试了不同浓度铜配物与BSA作用的圆二色谱(CD谱)，结果如图6。另外，利用相应的软件对CD谱进行BSA二级结构的计算，其计算结果见表3。

(a) BSA, 2.0×10-6M; (b) drug:BSA =0.5:1; (c) drug:BSA =1:1; (f) drug:BSA=10:1.

图6 铜配物与BSA作用的圆二色谱

如图6所示：随着铜配物的加入，BSA典型的二级结构负椭圆率峰逐渐降低，说明分子结构在加入铜配物后发生了变化，其α-螺旋含量有所减少，并且在较高浓度比时，这种现象很明显，说明此时肽链结构有所伸展。

表3 BSA二级结构在不同浓度铜配物作用下的变化结果

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(本文文献格式：江 阳.甘氨酸-水杨醛席夫碱和邻菲咯啉混合配体的铜(Ⅱ)配合物与蛋白质相互作用的光谱学研究[J].山东化工，2017，46(06)：51-53，56.)

2016-04-14

江 阳(1983—)，辽宁鞍山人，讲师,学士，主要研究方生物热化学。

Q51-3

A

1008-021X(2017)06-0051-03