合并与不合并2型糖尿病的下肢动脉硬化闭塞症患者血清差异性蛋白组学分析

杨晓虎，林裕辉，徐欣，范隆华

(1南通大学附属医院，江苏南通226001；2复旦大学附属中山医院)

合并与不合并2型糖尿病的下肢动脉硬化闭塞症患者血清差异性蛋白组学分析

杨晓虎1，林裕辉2，徐欣2，范隆华2

(1南通大学附属医院，江苏南通226001；2复旦大学附属中山医院)

目的 通过蛋白组学研究，鉴定合并2型糖尿病的下肢动脉硬化闭塞症(DLASO)患者与不合并2型糖尿病下肢动脉硬化闭塞症(LASO)患者血清的差异性蛋白，为防治2型糖尿病患者发生LASO提供依据。方法 收集DLASO、LASO各15例患者的血清，对蛋白进行提取、定量和酶解，应用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)结合二维液相色谱串联质谱(2DLC-MS/MS)技术，鉴定DLASO、LASO患者血清中的蛋白，筛选出DLASO患者与LASO患者的差异表达蛋白。利用PANTHER数据库对鉴定得到的差异性蛋白进行生物学过程、分子作用和细胞组分分析。结果 共鉴定出蛋白质338种，筛选出差异性蛋白27种，其中DLASO患者出现表达上调蛋白8种、表达下调蛋白19种。在生物学过程方面，差异性蛋白主要为参与细胞反应(48.1%)、代谢过程(48.1%)和生物黏附(29.6%)的蛋白；在分子作用方面，差异性蛋白主要为参与细胞结合作用(33.3%)、催化活性作用(29.6%)和结构分子活性作用(18.5%)的蛋白；在细胞组分方面，差异性蛋白主要为位于细胞区域(14.8%)、细胞器(14.8%)和细胞外区域(14.8%)的蛋白。结论 发现DLASO与LASO患者血清中的差异性蛋白27种，这些差异性蛋白可作为防治DLASO的潜在生物学靶点。

2型糖尿病；下肢动脉硬化闭塞症；蛋白组学；同位素标记；二维液相色谱串联质谱；差异性蛋白

全球范围内近2亿人口患有2型糖尿病，并且其患病率正在快速增加[1]。下肢动脉硬化闭塞症(LASO)是因动脉粥样硬化累及下肢动脉，导致动脉狭窄或闭塞而引起的肢体缺血慢性疾病，可以显著增加心肌梗死、中风等严重疾病的发生率和病死率。合并2型糖尿病时能加速动脉粥样硬化的进展，并增加外周动脉疾病的发病率。研究发现，合并2型糖尿病的患者发生LASO的患病率是不合并糖尿病患者的4倍，但其原因尚不明确[2]。因此，探讨合并2型糖尿病时对LASO发病影响的分子机制，对2型糖尿病下肢动脉硬化闭塞症(DLASO)的早期防治具有重要意义。2011年1月～2012年1月，我们应用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)结合二维液相色谱-串联质谱(2D LC-MS/MS)技术，鉴定DLASO 与不合并2型糖尿病的LASO患者的血清差异性蛋白，为阐明2型糖尿病影响LASO发病的分子机制提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择复旦大学附属中山医院同期收治的DLASO(DLASO组)和LASO(LASO组)患者各15例。DLASO组中男8例、女7例，年龄(67.40±2.72)岁，踝肱指数(ABI)为0.58±0.05。LASO组中男8例、女7例，年龄(67.64±3.34)岁，ABI为0.57±0.05。两组患者均根据症状体征及影像学检查确诊，均排除急性及慢性感染、肿瘤等系统性疾病。两组患者一般临床资料间差异没有统计学意义(P均>0.05)。本研究经复旦大学附属中山医院伦理委员会批准，标本采集经患者本人或家属的知情同意。

1.2 标本采集及高丰度蛋白去除 于清晨空腹时抽取两组患者肘静脉血，离心10 min，各取1.5 mL。用缓冲液A各稀释4倍，用0.22 μm离心过滤器离心1 min，上清利用亲和色谱柱Human 14 Multiple Affinity Removal System Columns免疫吸附14种高丰度蛋白。Bradford法对低丰度蛋白样品进行蛋白定量，每管100 μg分装，-80 ℃保存。

1.3 低丰度蛋白馏分 应用ITRAQ试剂标记方法，将低丰度蛋白(100 μg)放入4 ℃解冻后，加入6倍体积冻丙酮，反复颠倒3次混匀，-20 ℃保存直到沉淀，吸掉丙酮。取两组丙酮沉淀物100 μg，按ITRAQ试剂盒说明书进行蛋白还原及半胱氨酸修饰。向上述3份样本加入胰蛋白酶去离子水溶液，涡旋混合，37 ℃孵化过夜。将iTRAQ试剂放置于室温冻融，每管iTRAQ试剂加入无水乙醇70 mL，涡旋混合，使之溶解后转入真空干燥酶解样品管。两次技术重复中，以iTRAQ试剂116、117标记DLASO组，iTRAQ试剂115、117标记LASO组，分别取等量(20 μg)的血清、低丰度蛋白、高丰度蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，以评估亲和柱去除高丰度蛋白的效能。

1.4 强阳离子交换色谱(SCX)分级及质谱分析 应用SCX分级，经过标记的干燥样本混合品加入200 μL SCX 缓冲液 A (10 mmol/L KH2PO4pH 3.0，25% ACN)复溶上样，再经B相缓冲液(10 mmol/L KH2PO4pH 3.0，500 mmol/L KCl，25% ACN)以0～100%的浓度梯度、1 000 mL/min流速洗脱75 min。经过收集穿流及洗脱后，得到10个组分，组分用C18 Cartridge(Sigma)脱盐并冷冻抽干。分层后样本经毛细管高效液相色谱脱盐及分离，然后用LTQ VELOS质谱仪(Thermo Finnigan，San Jose，CA)进行质谱分析。

1.5 蛋白质的鉴定和定量 所有串联质谱原始数据使用Sequest软件进行搜库，数据库为International Protein Index(IPI)v3.53人类蛋白质数据库，Sequest结果过滤参数为：蛋白质假阳性率(FDR)≤1%；ΔCN≥10%。应用Proteomics Tools分析软件抽提肽段报告离子峰定量信息，并以iTRAQ标记114组为内参，对信号强度进行归一化处理分析。以采用软件计算的各肽段比值的加权平均值作为蛋白质定量结果。

1.6 差异性蛋白评价标准 对DLASO组及LASO组蛋白质进行相对定量后，排除高丰度蛋白，以iTRAQ表达改变2倍作为阈值选取差异性蛋白，>2.0为DLASO患者的上调蛋白，<0.5为下调蛋白。

1.7 差异性蛋白的生物学功能分析 利用PANTHER数据库对鉴定得到的差异性蛋白进行生物学过程、分子作用和细胞组分的分析。

2 结果

2.1 差异性蛋白筛选结果 质谱原始数据通过Sequest软件搜库，共鉴定出蛋白质338种。筛选出差异性蛋白27种，其中DLASO组出现表达上调蛋白8种，表达下调蛋白19种。见表1、2。

2.2 生物学功能分析结果 在生物学过程方面，差异性蛋白主要为参与细胞反应(48.1%)、代谢过程(48.1%)和生物黏附(29.6%)的蛋白；在分子作用方面，差异性蛋白主要为参与细胞结合作用(33.3%)、催化活性作用(29.6%)和结构分子活性作用(18.5%)的蛋白；在细胞组分方面，差异性蛋白主要为位于细胞区域(14.8%)、细胞器(14.8%)和细胞外区域(14.8%)的蛋白。

表1 DLASO组与LASO组比较的表达上调蛋白

表2 DLASO组与LASO组比较的表达下调蛋白

3 讨论

LASO是一种常见的慢性、渐进性疾病。流行病学研究表明，2型糖尿病可明显增加发生LASO的风险，导致缺血性溃疡和截肢等功能性损伤的发生[3]。临床和基础研究发现，DLASO与遗传、免疫、环境、生活方式等多种因素有关，是多因素、多通道导致的复杂疾病。研究疾病发生发展过程中出现或表达量改变的差异性蛋白，可以揭示疾病发生发展的机制，对于了解差异性蛋白在DLASO的发病中的不同生物学作用，阐明DLASO发病机制具有重要意义。

差异蛋白质组学着重寻找和筛选任何有意义的因素引起的2个样本之间的差异蛋白质谱，可揭示细胞生理和病理状态的进程与本质、对外界环境刺激的反应途径，获得对某些关键蛋白的定性和功能分析。差异蛋白质组学反映了蛋白质的动态本质，在生物体及其每一个细胞内，各种蛋白质的表达、修饰、定位和代谢都在随时发生严格受控的改变。蛋白质调节其他蛋白或者被其他蛋白所调节，同一种蛋白质在不同的时间、空间上也可能具有不同的生物学功能。差异蛋白质组学成为蛋白质组学研究的前沿，目前国内外应用该技术分析DLASO与LASO差异蛋白表达鲜见报道。本研究通过蛋白组学分析技术发现，DLASO组与LASO组血清中存在27种差异性表达蛋白，这些差异性蛋白主要参与了细胞反应、代谢过程和生物黏附等过程；差异性表达的蛋白中，表达上调的蛋白8种、表达下调的蛋白19种，其中IGFBP5、PCSK9蛋白表达明显上调，BLVRB蛋白表达明显下调。

IGFBP5蛋白可与胰岛素样生长因子(IGF)结合，通过控制IGFs与信号受体的相互作用，调节细胞的有丝分裂过程[4]。同时IGFBP5蛋白可不依赖IGFs，直接结合到细胞表面的假定受体上，或直接调节细胞核中的基因表达[5]。IGFBP5蛋白参与多种生物学功能，包括细胞增殖、分化、衰老和凋亡[6]。研究证明，IGFBP5蛋白与2型糖尿病所致的细胞外基质积累明显相关，参与了2型糖尿病致视网膜病变的病理过程，2型糖尿病视网膜病变患者血管内皮细胞中，IGFBP5蛋白的表达较非2型糖尿病视网膜病变患者明显上调[7]。本研究发现，DLASO组IGFBP5蛋白表达较LASO组明显上调，提示IGFBP5蛋白在2型糖尿病加速LASO的发生发展过程中可能起着一定作用。

PCSK9蛋白是哺乳动物枯草杆菌蛋白酶家族的一个成员，由肝脏合成，以转录后的方式促进肝脏LDL受体(LDLR)的降解，从而促进循环中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的积聚[8]。研究[9]证明，PCSK9是导致2型糖尿病患者高胰岛素血症性血脂异常发生发展的主要原因，2型糖尿病患者血液中PCSK9水平与LDL-C呈正相关。血浆中LDL-C是动脉粥样硬化及其相关的缺血性心血管疾病最重要的致病因素[10]。因此，PCSK9蛋白在2型糖尿病致LASO过程中可能存在着重要的作用。本研究发现，DLASO组PCSK9蛋白表达较LASO组明显上调，提示PCSK9蛋白在2型糖尿病致LASO过程中参与了动脉硬化病理过程，并起到了重要作用。

BLVRB蛋白是胆绿素还原酶的亚型，由206个氨基酸组成，质量为21 kD。BLVRB蛋白主要在肝脏合成，具有黄素还原酶和铁还原酶的活性[11,12]，与细胞信号转导和基因表达的调控密切关系，可能在保护细胞免受氧化应激损伤中有重要作用[13～15]。大量的研究证明，氧化应激是2型糖尿病并发血管疾病的主要原因。本研究发现，DLASO组BLVRB蛋白表达较LASO组明显下调，提示氧化应激在DLASO病理过程中起到了一定作用，但其功能尚不清楚。

总之，本研究应用iTRAQ结合2D LC-MS/MS技术对DLASO和LASO患者血清进行了差异蛋白质组学分析，共筛选出27种差异性蛋白，这些差异性蛋白主要为参与细胞反应、代谢过程和生物黏附等过程的蛋白，表明这些生物过程可能参与了DLASO的病理过程，这些差异蛋白可作为DLASO患者防治的潜在生物学靶点。但本研究仅为初步性蛋白筛选研究，而且样本量相对较少，需要进一步大样本验证，并进行临床和实验研究，以明确不同的差异性蛋白在DLASO中的作用和分子机制。

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Proteomics analysis on serum differential proteins between lower limb arteriosclerosis obliterans patients with and without type 2 diabetes mellitus

YANGXiaohu1,LINYuhui,XUXin,FANLonghua

(1TheAffiliatedHospitalofNantongUniversity,Nantong226001,China)

Objective To identify the differentially expressed proteins between lower limb arteriosclerosis obliterans patients with type 2 diabetes mellitus (DLASO) and patients without type 2 diabetes mellitus (LASO) by the proteomic research. Methods Serum samples were separately collected from DLASO patients and LASO patients (15 cased in each group). Isobaric tags for relative and absolute quantitation (iTRAQ)-tagging combined with two-dimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry (2D LC-MS/MS ) analysis were used to identify the differentially expressed proteins between DLASO patients and LASO patients. The differentially expressed proteins were analyzed for biological processes, molecular effects and cell composition by using PANTHER database. Results Compared with LASO patients, a total of 27 differentially expressed proteins were identified in DLASO patients, 8 proteins were significantly up-regulated while 19 proteins were significantly down-regulated. Biological process analysis showed that the differential protein was mainly involved in cell reaction (48.1%), metabolic process (48.1%), and bioadhesion (29.6%). The results of molecular analysis showed that the differential protein was mainly involved in cell binding (33.3%), catalytic activity (29.6%), and structural molecule activity (18.5%). Cell composition analysis showed that the differential proteins were mainly located in the cell region (14.8%), organelles, (14.8%) and extracellular regions (14.8%).Conclusion Totally 27 differentially expressed proteins between DLASO and LASO patients are identified by proteomic research, which may be used as potential biological targets for the prevention and treatment of DLASO.

type 2 diabetes mellitus; lower limb arteriosclerosis obliterans; proteomics; isotope labelling; two-dimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry; differentially expressed proteins

上海市科学技术发展基金资助项目(11ZR1406900)。

杨晓虎(1986-)，男，硕士，主治医师，研究方向为血管及肿瘤介入。E-mail: 3245941668@qq.com

范隆华(1968-)，男，主任医师，研究方向为血管外科。E-mail: fan.longhua@zs-hospital.sh.cn

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.30.005

R543.5；R587.1

A

1002-266X(2017)30-0018-04

2017-02-16)