悬浮组织块法分离培养SD大鼠脂肪干细胞的实验研究

刘 琴 王丽平 陈 芳 李晓明 朱以良 张 宜

(中国人民解放军武汉总医院医学实验科，武汉430070)

悬浮组织块法分离培养SD大鼠脂肪干细胞的实验研究

刘 琴 王丽平 陈 芳 李晓明 朱以良 张 宜

(中国人民解放军武汉总医院医学实验科，武汉430070)

目的：建立SD大鼠脂肪干细胞悬浮组织块分离培养法。方法：取正常SD大鼠股沟处脂肪组织，用悬浮组织块法和组织块贴壁法分离培养SD大鼠脂肪干细胞，观察细胞的生长状况及形态特征。取第3代对数期细胞，CCK- 8法绘制其生长曲线；免疫荧光法检测其表面抗原CD29、CD44、CD45的表达情况；分别用成脂、成骨诱导培养液进行诱导分化，油红O、茜素红染色定性鉴定。结果：两种方法体外培养得到的SD大鼠脂肪干细胞形态为梭形纤维样，生长力旺盛，生长曲线为典型的“S”型；免疫荧光法检测显示第3代细胞强表达CD29、CD44，CD45表达阴性；细胞成脂诱导培养14 d后，油红O染色为阳性；成骨诱导培养14 d后，茜素红染色为阳性。结论：悬浮组织块法可以分离培养出SD大鼠脂肪干细胞，方法简便，为体外分离培养SD大鼠脂肪干细胞提供了一种新的方法。

悬浮组织块法；SD大鼠脂肪干细胞；分离；培养

脂肪组织是成体间充质干细胞的重要来源之一，其提供的间充质干细胞数量远大于其他组织来源。脂肪干细胞(Adipose- derived stem cells,ASCs)具有良好的增殖能力和自我更新能力，在合适的条件下能够分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、神经细胞、内皮细胞等，在基础医学研究领域及临床领域具有良好的应用前景[1- 3]。近几年来，组织块贴壁法是体外培养ASCs的主要方法之一，但此法存在着一个很大的缺陷，即组织块贴壁容易脱落[4，5]。众所周知，适宜大小的脂肪组织块在一定体积的液体中具有悬浮性。目前，国内外还没有采用悬浮组织块法分离培养ASCs的相关报道，故本文以SD大鼠脂肪组织为研究对象，采用悬浮组织块法分离培养SD大鼠ASCs。

1 材料与方法

1.1 材料 SD大鼠4只，雄性，3周龄(武汉市新洲区万千佳禾实验动物养殖场提供)。PBS、DMEM- F12培养基购自Hyclone；胎牛血清购自Gibco；胰酶、青链霉素双抗、CCK- 8、DAPI染色液、4 % 多聚甲醛、CCK- 8购自碧云天；成脂、成骨诱导试剂盒购自Cyagen公司；PE- CD29、FITC- CD44、PE- CD45购自Biolegend；倒置显微镜(CK2- TR)、倒置荧光显微镜购自Olympus；CO2细胞培养箱(MCO- 175)购自日本三洋。

1.2 方法

1.2.1 悬浮组织块法 参考文献[6]，取大鼠腹股沟处脂肪组织，PBS漂洗2～3次，尽量清除组织中肉眼可见的筋膜和小血管，剪成绿豆大小，接种到6 cm平皿，每皿5～7块，加入6～7 ml培养液使组织块悬浮，轻轻晃匀后置于37℃、5%CO2培养箱内培养。5 d后首次换液。细胞达90% 左右融合时，用胰酶进行1∶2或1∶3传代，记为第一代(P1)。

1.2.2 组织块贴壁法 按照参考文献[7]，取大鼠腹股沟处脂肪组织，PBS漂洗2～3次，尽量清楚组织中肉眼可见的筋膜和小血管，无菌滤纸吸干组织表面的水分后剪成约绿豆大小，接种到6 cm平皿，10～15块/皿，放入37℃、5%CO2培养箱内倒置培养20～30 min，加入4～6 ml培养液，继续培养。3 d后首次换液，待细胞达到90%左右融合时，用胰酶进行1∶2或1∶3传代，记为第一代(P1)。

1.2.3 CCK- 8法测细胞增殖能力 取第三代培养的细胞(P3)，接种到96孔培养板(2×103/孔)，每组5个复孔，每天随机取出一组用CCK- 8法检测细胞的OD450值，共检测7 d，根据OD450值绘制细胞生长曲线。的6孔板，培养2 d后弃培养液，PBS洗2～3次，4 % 多聚甲醛溶液4℃ 固定20 min，PBS洗3次，山羊血清室温封闭30 min，吸水纸吸去封闭液，加入PE- CD29、FITC- CD44、PE- CD45(1∶100稀释)，将培养板放入湿盒，4℃ 过夜，PBS洗3次，加DAPI染色液避光孵育5 min，PBST 5 min×4次，吸干爬片上的液体，封片，显微镜下观察并拍照。

1.2.4 细胞成脂、成骨分化潜能的鉴定 根据成脂、成骨诱导分化试剂盒所提供的说明书进行。简要步骤如下，将P3 ASCs以2×104个/cm2接种入6孔板，细胞达70%左右融合时加入成脂或成骨诱导液，按时进行换液，诱导14 d后进行油红O或茜素红染色，显微镜下拍照。

2 结果

2.1 细胞形态观察 悬浮法接种48～72 h后，可见少量细胞生长，形态以长梭形为主，少数为多角形、圆形。8 d后可见大量细胞生长，细胞透明度大、折光性强、轮廓不清。10～11 d时，细胞达到90% 融合，可见大量成纤维样细胞呈明显的漩涡状生长，初步判断所得细胞为ASCs。贴壁法接种2～3 d可见少量细胞生长，7～9 d左右达到90% 融合，培养出来的细胞5～6 d可传代一次。两种方法所得到细胞的细胞形态见图1。

2.2 细胞增殖能力 两种方法所得细胞经过短暂的潜伏期后约在第3天进入生长旺盛期，第7天进入平台期，绘制出来的生长曲线呈典型的“S”形，表明两种方法所得细胞均具有较强的增殖能力，见图2。

2.3 细胞表型 免疫荧光法检测两种方法所得细胞的细胞表型，结果显示:细胞强表达CD29、 CD44，CD45表达阴性，表明两种方法所得细胞具有ASCs细胞表型特征，见图3。

2.4 成脂诱导分化 两种方法所得的细胞诱导2周时出现大量脂滴，油红O染色，有大量红染颗粒，表明两种方法获得的细胞都具有成脂分化能力，见图4。

图1 原代SD大鼠ASCs培养Fig.1 Primary culture of SD rat adipose- derived stem cellsNote: Explant adherent culture method:A.Primary culture for 3 days;B.Primary culture for 10-11 days;C.The third passage cells.Suspended explant culture method:D.Primary culture for 3 days;E.Primary culture for 10-11 days;F.The third passage cells.

1.2.4 细胞表型鉴定 取P3细胞，接种到含爬片

图2 SD大鼠ASCs生长曲线Fig.2 Growth curve of SD rat adipose- derived stem cellsNote: The cells entered the logarithmic growth phase on the third day,and the OD450 was unchanged on the seventh day.

图4 SD大鼠ASCs成脂诱导Fig.4 Adipogenic induction of SD rat adipose- derived stem cellsNote: A.Explant adherent culture method;B.Suspended explant culture method.

图5 SD大鼠ASCs成骨诱导Fig.5 Osteogeinc induction of SD rat adipose- derived stem cellsNote: A.Explant adherent culture method;B.Suspended explant culture method.

2.5 成骨诱导分化 两种方法所得的细胞诱导2周时可见多角形、不规则形细胞堆积，呈明显的簇状生长，茜素红染色，有大量桔红色的钙结节，表明两种方法获得的细胞都具有成骨分化能力，见图5。

3 讨论

目前，ASCs分离培养的主要方法之一为组织块贴壁法，此法存在的一大难点是换液和移动细胞瓶/皿的过程中很容易导致脂肪组织块的脱落[8，9]。为了使脂肪组织块贴壁更加牢固，有研究者吸去脂肪组织块表面附着的多余水分，再将组织块接种到培养瓶[10]；或者将接种有脂肪组织块的培养瓶在培养箱内倒置培养一段时间后再轻轻加入培养液[11]。众所周知，适宜大小的脂肪组织块在一定体积的液体中具有悬浮性。陈义等[12]利用悬浮基质片法成功培养出兔角膜基质细胞。另有研究者采用悬浮滑膜组织块法成功分离培养出兔成纤维样滑膜细胞[6]。本实验借助脂肪组织块的悬浮性来分离培养SD大鼠ASCs，并与组织块贴壁法进行比较。

从3周龄SD大鼠股沟处获得脂肪组织，剪成5 mm3大小，加入含体积分数10 % 胎牛血清的DMEM- F12培养液，使组织块处于悬浮状态或贴壁状态，37℃、5 % CO2条件下培养，两种方法在接种2～3 d后均可见细胞生长。不同的是悬浮组织块法需10～11 d达到90%融合，组织块贴壁法7～9 d达到90%融合。但是，两种方法获得的细胞5～6 d可传代一次，细胞形态以典型的长梭形为主，呈明显的漩涡状生长。采用CCK- 8法检测显示培养出来的SD大鼠ASCs P3细胞呈现典型的“S”形。上述结果表明悬浮组织块法所得到的SD大鼠ASCs符合鉴定间充质干细胞标准之一——黏附性[13]，且符合干细胞的生长规律[14]。

鉴定间充质干细胞另外2个基本标准为间充质干细胞所具有的细胞表型和多向分化潜能[13]。至今为止，研究者们对于ASCs的特异性标记物仍然存在一定的争议，尤其是CD34[15]。国际细胞治疗协会在2006年规定CD34为ASCs的阴性标记物[16]。然而，有研究发现早期培养的ASCs能表达CD34[17]。实验选用具有鉴别意义的细胞表型标记物CD29、CD44、CD45[18]。免疫荧光法检测结果显示两种方法获得的SD大鼠ASCs均强表达CD29、CD44，CD45表达阴性，与文献研究一致[19，20]。为证实悬浮组织块法获得的SD大鼠ASCs具有向脂肪细胞、成骨细胞分化的能力，取P3细胞分别进行成脂、成骨诱导，结果显示，两种方法得到的细胞诱导分化后油红O染色、茜素红染色均为阳性，与文献研究一致[21]。表明悬浮组织块法得到的SD大鼠ASCs具有向脂肪细胞、成骨细胞分化的潜能。

本实验采用悬浮组织块法成功分离培养出SD大鼠ASCs，与组织块贴壁法相比，悬浮组织块法具有一定的优势:①处理时间缩短。②操作简单，组织块贴壁法需要人为地将脂肪组织块一块一块地接种均匀，而悬浮组织块法只需轻轻晃动培养瓶/皿即可接种均匀。③此法可克服组织块贴壁法组织块贴壁易脱落的问题。④可提高脂肪组织的利用率。但是在采用悬浮组织块法分离培养SD 大鼠ASCs时有两点注意的事项:①脂肪组织块的接种量是采用悬浮组织块法成功培养出脂肪干细胞的关键，如一个6 cm培养皿接种5～7块5 mm3大小的脂肪组织块即可，组织块太多则长不出细胞。②为区别于组织块贴壁法，一定要加入足够量的培养液使脂肪组织块悬浮起来。本次实验只是从定性角度说明悬浮组织块法可以培养出SD大鼠ASCs，后续实验将从定量角度比较悬浮组织块法与组织块贴壁法的优缺点，比如产量、流式细胞仪分析细胞标志物的具体表达量、多向诱导分化的阳性率及相关基因的表达等。

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[收稿2017- 02- 23 修回2017- 03- 22]

(编辑 许四平 刘格格)

An experimental study of isolation of SD rat adipose- derived stem cells using suspended explant culture method

LIU Qin,WANG Li- Ping,CHEN Fang,LI Xiao- Ming,ZHU Yi- Liang,ZHANG Yi.

Department of Medical Experiments,Wuhan General Hospital of Chinese People′s Liberation Army,Wuhan 430070,China

Objective:To isolate SD rat adipose- derived stem cells(ASCs)by suspended explant culture method.Methods: The healthy rat inguinal fat pads were obtained.The SD rat ASCs were isolated by suspended explant culture method and explant adherent culture method.The growth status and morphology were observed.The growth curve and cell surface markers CD29,CD44,CD45 of the 3rd passage cells were analyzed respectively by CCK- 8,immunocytochemistry;the 3rd passage cells were induced individually by adipogenic differentiation medium and osteogenic differentiation medium,and cells were examined by oil red O staining and alizarin red staining.Results: The SD rat ASCs obtained by the two methods exhibited a spindle- shaped appearance and could rapidly expand.The cell growth curves were typical of "S" type.Immunocytochemistry analysis revealed that the third passage of SD rat ASCs were positive for CD29,CD44,but were negative for CD45.SD rat ASCs were positive for oil red O staining at 14 days after adipogenic induction,and positive for alizarin red staining at 14 days after osteogenic induction.Conclusion: Isolation of SD rat ASCs by suspended explant culture method is successfully established.The method is simple.It provides a new method for the isolation of SD rat ASCs in vitro.

Suspended explant culture method;SD rat ASCs;Isolation;Culture

10.3969/j.issn.1000- 484X.2017.08.015

刘 琴(1986年-)，女，硕士，技师，主要从事细胞生物学和分子生物学方面的研究，E- mail:liuqin_0629@163.com。

及指导教师：张 宜(1965年-)，男，硕士，主任药师，主要从事药学信息研究，E- mail:abcd1566@sina.com。

R392.33

A

1000- 484X(2017)08- 1197- 04