辛二酰苯胺异羟肟酸通过抑制组蛋白去乙酰化酶改善小鼠心肌肥厚的研究

彭昌，李硕，罗孝美，谢新星，肖明晨

辛二酰苯胺异羟肟酸通过抑制组蛋白去乙酰化酶改善小鼠心肌肥厚的研究

彭昌，李硕，罗孝美，谢新星，肖明晨

目的：探讨组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂辛二酰苯胺异羟肟酸（SAHA）改善小鼠心肌肥厚的作用，为防治心肌肥厚提供新思路。

方法：选取60只昆明小鼠，随机分为正常组、假手术组、心肌肥厚组、心肌肥厚+ SAHA组,通过部分结扎小鼠胸主动脉建立心肌肥厚模型，最终每组纳入6只。采用苏木素伊红（HE）染色观察小鼠心肌细胞，超声心动图检测小鼠心功能，比色法检测HDAC活性，小鼠心肌组织中HDAC亚型HDAC5和β-肌球蛋白重链（β-MHC）信使核糖核酸（mRNA）和蛋白表达水平分别运用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白免疫印迹（Western blot）检测。

结果：HE染色结果表明心肌肥厚组小鼠心肌细胞肥大、排列紊乱、细胞核深染。心肌肥厚组小鼠左心室舒张末期直径、左心室舒张末期容积均显著低于假手术组（P＜0.05），而室间隔明显较假手术组增厚（P＜0.05）。心肌肥厚组小鼠HDACs活性显著高于假手术组（P＜0.05）；心肌肥厚组HDAC5和β-MHC的mRNA及蛋白表达水平均显著高于假手术组（P＜0.05）。SAHA能够显著降低HDAC5表达水平，显著下调心脏肥厚相关基因β-MHC的表达并改善小鼠心功能和心肌肥厚（P 均 ＜0.05）。

结论：HDAC参与了心肌肥厚的发生，HDAC抑制剂SAHA通过抑制HDAC5的表达从而改善小鼠心肌肥厚。

组蛋白去乙酰化酶1；心脏扩大；治疗结果

(Chinese Circulation Journal, 2017,32:803.)

心肌肥厚是多种心脏疾病的必经阶段，如未及时控制，最终将发展为心力衰竭甚至猝死[1,2]。关于心肌肥厚的发生机制仍不十分清楚，且目前的治疗手段除了利尿、扩血管等对症处理外尚无有效改善心肌肥厚的特殊措施。研究表明，表观遗传的组蛋白乙酰化修饰可能参与了心肌肥厚的发生、发展过程[3-5]。这提示我们从表观遗传的全新角度去探讨心肌肥厚的发生机制将有助于寻找心肌肥厚的干预新靶点。因此，本研究通过建立小鼠心肌肥厚模型深入探讨组蛋白乙酰化调控在心肌肥厚中的作用，为心肌肥厚的防治提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

将60只8～10周昆明小鼠（购置于遵义医学院动物中心）随机分为正常组、假手术组、心肌肥厚组、心肌肥厚+辛二酰苯胺异羟肟酸（SAHA）组，每组15只。心肌肥厚组给予部分结扎胸主动脉（约为胸主动脉直径的2/3），心肌肥厚+ SAHA组除部分结扎胸主动脉外，同时给予SAHA[50 mg/（kg·d），Santa Cruz，Texas，美国]腹腔注射，每日1次连续注射30天，假手术组给予等量生理盐水腹腔注射，正常组未予任何处理。除去手术及干预过程中死亡的小鼠，最终每组选6只小鼠纳入实验。

1.2 心脏标本的制备

选取建模成功后的小鼠，二氧化碳麻醉处死，75%乙醇消毒并剖开胸腔，分离心脏放入预冷PBS液（KH2PO40.27 g，Na2HPO41.42 g，NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，用浓盐酸调节至pH7.6，加水至1000 ml）中清洗后置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.3 主要实验方法

10 %水合氯醛腹腔麻醉小鼠后，运用Vevo 770高频超声行超声心动图检查。检查结束后剖开胸腔，取出心脏，置于4 %多聚甲醛溶液中4 ℃固定48 h切片进行苏木素伊红（HE）染色。

心肌组织匀浆后，运用核蛋白提取试剂盒（Merck Millipore, 德国）提取核蛋白，参照文献[6]运用比色法检测试剂盒（GenMed，上海）检测组蛋白去乙酰化酶（HDAC）活性，运用酶标仪在450 nm波长范围测量50 μg蛋白样品量的光密度（OD）值，严格按照说明书操作。HDAC活性= OD值/50 μg蛋白。

逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）：针对β-肌球蛋白重链（β-MHC）和HDAC亚型HDAC5基因CDS核心编码区设计引物，引物用Primer Premier 5.0 软件设计，由宝生物公司合成。将基因产物进行梯度稀释，运用Bio-Rad CFX96荧光定量聚合酶链反应（PCR）仪扩增，做出标准曲线，得到R2值和扩增效率。引物序列：β-MHC（F） 5' -TGAGACGGATGCCATACAGA-3', β-MHC（R） 5'-GCA GCCTGTGCTTGGTCTT-3'，产物大小：176 bp。反应条件：预变性：95℃ 30 s，变性：95℃5 s，退火延伸：58℃ 30 s，39个循环；HDAC5 （F）5’-CAATCATCGGTATGTCTGCG-3’，HDAC5 （R）5’- CCTGTCCATGACGTTGT GTGCA-3’，产物大小：144 bp。反应条件：预变性：95℃ 30 s，变性：95℃5 s，退火延伸：57℃ 30 s，39个循环。选取β-肌动蛋白（β-actin）作为内参，引物序列：β-actin （F）5’-CCTTTATCGGTATGGAGTCTGCG-3’，β-actin（R） 5’-CCTGACAT TTGTTGGCA-3’，产物大小：104 bp。反应条件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，59℃ 30 s，39个循环。所得数据用PCR仪自带基于pfaffl原理的相对定量数据分析软件处理。

蛋白免疫印迹（Western blot）检测：提取小鼠心肌组织核蛋白，8% SDS-PAGE凝胶分离蛋白，聚偏氟乙烯（PVDF）膜半干转膜后，5 %脱脂牛奶封闭1 h分别加入兔来源抗HDAC5和β-MHC单克隆抗体（Abcam，英国，1：1000）及甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）兔来源多克隆抗体（Abcam，英国，1：3000），4 ℃孵育过夜，TBST（2.42 g Tris碱，8.06 g NaCl，0.5 ml Tween-20溶于1000 ml蒸馏水中，用浓盐酸调节pH至7.5）洗涤3次，每次10 min，然后加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔的二抗（中杉金桥，北京，1：5000） 脱色摇床上孵育2 h，TBST洗涤3次，每次10 min；运用Bio-Rad图像分析仪进行图像扫描，采用Quantity One 4.4软件进行分析。

1.4 统计学分析

应用SPSS 21.0统计软件包进行统计学分析。所有数据均用±s表示，多组间比较进行单因素方差分析，组间比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 各组小鼠心功能情况比较（±s）

2 结果

2.1 各组小鼠心肌组织HE染色结果

HE染色结果表明：正常组和假手术组小鼠心肌细胞排列规则，细胞大小均匀一致（图1A、1B），心肌肥厚组HE染色可见小鼠心肌细胞肥大，排列紊乱，细胞核变大，染色较深（图1C）。但是，心肌肥厚+SAHA组小鼠心肌细胞较心肌肥厚组肥大有所减轻，细胞核也较心肌肥厚组变小，心肌细胞排列规则（图1D）。

图1 各组小鼠心肌组织苏木素伊红染色结果

2.2 各组小鼠心功能情况比较（表1）

超声心动图结果表明：心肌肥厚组小鼠心脏左心室舒张末期内径（LVEDD）和左心室舒张末期容积（LVEDV）均显著低于假手术组（P＜ 0.05），室间隔（IVS）厚度在心肌肥厚组显著高于假手术组（P＜0.05）。而左心室收缩末期内径（LVESD）和左心室收缩末期容积（LVESV）心肌肥厚组与假手术相比差异无统计学意义（P＞ 0.05）。而HDAC抑制剂SAHA能够显著提高LVEDD和LVEDV，心肌肥厚+ SAHA组与心肌肥厚组相比差异有统计学意义（P＜ 0.05）。

2.3 各组小鼠心肌组织中HDAC活性比较（表2）

比色法结果表明：心肌肥厚组小鼠心肌组织中HDAC活性明显高于假手术组，两者相比差异有统计学意义（P＜0.05）。而HDAC抑制剂SAHA能够显著降低小鼠心肌组织中HDAC活性，心肌肥厚+SAHA组与心肌肥厚组相比差异有统计学意义（P＜ 0.05）。

表2 各组小鼠心肌组织中HDAC活性比较（±s）

2.4 各组小鼠心肌组织中HDAC5和β-MHC mRNA表达量比较（图2）

RT-PCR结果显示：HDAC5和心肌肥厚相关基因β-MHC mRNA表达水平在心肌肥厚组均显著高于假手术组，两组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。而心肌肥厚+ SAHA组HDAC5和β-MHC mRNA表达水平均显著低于心肌肥厚组（P＜0.05）。2.5 各组小鼠心肌组织中HDAC5蛋白表达水平（图3）

图2 各组小鼠心肌组织中HDAC5和β-MHC mRNA表达量比较（n=6）

Western blot结果表明：心肌肥厚组小鼠心肌组织中HDAC5的蛋白表达水平显著高于假手术组（P＜0.05），而心肌肥厚+ SAHA组小鼠心肌组织中HDAC5蛋白表达水平显著低于心肌肥厚组（P＜0.05）。2.6 SAHA抑制心肌肥厚小鼠心肌组织中β-MHC蛋白表达（图4）

图3 各组小鼠心肌组织中HDAC5蛋白表达水平（n=6）

Western blot结果表明：心肌肥厚组小鼠心肌组织中心肌肥厚相关基因β-MHC的蛋白表达量显著高于假手术组（P＜0.05），而心肌肥厚+SAHA组小鼠心肌组织中β-MHC的蛋白表达量显著低于心肌肥厚组（P＜0.05）。

图4 各组小鼠心肌组织中β-MHC蛋白表达水平（n=6）

3 讨论

心肌肥厚是多种心脏疾病的病理过程，是心功能不全或心力衰竭之前的一个重要阶段[7]。但对该病理过程发生发展的机理并不十分明确，也无确切有效的治疗方法[8,9]。近年来，研究发现表观遗传学参与调控了这一过程，但表观遗传学研究内容广泛，其中的组蛋白乙酰化是较为重要的一种翻译后修饰方式[10,11]。因此，本课题组通过部分结扎小鼠胸主动脉建立小鼠心肌肥厚模型，从表观遗传学的角度探讨心肌肥厚的发生机制。

本研究发现心肌肥厚模型小鼠的心肌组织中HDAC活性显著增高，尤其是HDAC5的表达水平在心肌肥厚的小鼠心肌组织中显著增高，这提示HDAC可能参与了心肌肥厚（梗阻性或压力超载性）的发生、发展，这与其他报道相一致[12,13]。研究发现，心脏发育相关基因受到组蛋白乙酰化调控，且组蛋白乙酰化和组蛋白去乙酰化是体内共同维持基因稳态的一对重要修饰方式，其在体内稳态的维持是保证机体正常生理机能得以进行的基本因素[14,15]。HDAC的主要作用是使染色质结构紧密，不利于基因转录，而组蛋白乙酰化酶作用正好相反[16]。本研究发现HDAC活性在心肌肥厚小鼠心肌组织中是显著增高的，而心肌肥厚相关基因β-MHC的表达也是显著增高的。生理状态下，组蛋白去乙酰化是抑制基因的转录表达，本研究结果发现，HDAC及其亚型HDAC5的表达水平是显著升高的，理论上应该是抑制β-MHC基因的表达（β-MHC呈低表达），而我们的结果正好与此相反（β-MHC呈高表达），表明该实验结果与生理状态下组蛋白乙酰化修饰规律并不完全相同，这可能提示HDAC在调控小鼠心肌肥厚中并不是直接作用于小鼠心肌肥厚相关基因β-MHC，而有可能是通过调控其他基因进而间接导致心肌肥厚相关基因β-MHC的过表达，引发小鼠体内心脏发育相关基因之间的稳态失衡从而导致心肌肥厚的发生。这也与国外报道相类似[17]。

本课题组前期研究证实，组蛋白乙酰化酶参与了小鼠心肌肥厚的调控，并证实组蛋白乙酰化酶抑制剂漆树酸能够部分改善小鼠心肌肥厚[18]。而在本实验中我们发现HDAC抑制剂SAHA能够显著降低HDAC5过表达，且小鼠肥大的心肌细胞及心功能在SAHA处理组均较心肌肥厚组有显著改善，这些结果表明组蛋白去乙酰化调控也参与了心肌肥厚这一病理过程，也提示HDAC抑制剂SAHA可以作为心肌肥厚防治的候选药物。但是对于SAHA能否用于临床防治心肌肥厚尚需更多的相关研究证实。

综上所述，HDAC参与了小鼠心肌肥厚的发生发展的调控，且HDAC抑制剂SAHA能够部分逆转小鼠心肌肥厚，然而组蛋白乙酰化酶和HDAC均参与了小鼠心肌肥厚的调控，联合运用二者的抑制剂能否完全逆转心肌肥厚，彻底改善心肌肥厚及心功能尚有待进一步研究证实。

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Suberoylanilide Hydroxamic Acid Improves Cardiac Hypertrophy via Inhibiting Histone Deacetylase in Experimental Mice

PENG Chang, LI Shuo, LUO Xiao-mei, XIE Xin-xing, XIAO Ming-chen.
Department of Pediatrics, The Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Zunyi (563000), Guizhou, China

PENG Chang, Email: pengchang_2006@126.com

Objective: To explore the effect of suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA) improving cardiac hypertrophy via inhibiting histone deacetylases (HDAC) in experimental mice and to provide a new idea for prevention and treatment of cardiac hypertrophy.

Methods: Cardiac hypertrophy mice model was established by thoracic aorta ligation. A total of 60 Kunming mice were randomly divided into 4 groups: Normal control group, Sham operation group, Cardiac hypertrophy (CH) group and CH+SAHA group. There were 6 mice used in each group. Myocardial cell morphology was observed by HE staining, cardiac function was assessed by echocardiography, mRNA and protein expressions of HDAC5 (the isoform of HDAC) and β-MHC were examined by RT-PCR and Western blot analysis.

Results: The mice in CH group had myocardial cell hypertrophy, disordered arrangement and hyperchromatic nucleus. Compared with Sham operation group, CH group showed decreased left ventricular end diastolic diameter (LVEDD), left ventricular end diastolic volume (LVEDV) and increased thickness of inter-ventricular septum (IVS), all P＜0.05; CH group presented elevated mRNA and protein expressions of HDAC5 and β-MHC, P＜0.05. SAHA obviously decreased HDAC5 expression, down regulated cardiac hypertrophy related β-MHC gene expression, improved cardiac function and hypertrophy, all P＜0.05.

Conclusion: HDAC were involved in myocardial hypertrophy; SAHA could inhibit HDAC expression and therefore,improved myocardial hypertrophy in experimental mice.

Histone deacetylasel l; Cardiomegaly; Treatment Outcome

book=803,ebook=79

2016-10-05）

（编辑：王宝茹）

国家自然科学基金项目（81560040）；遵义医学院博士启动基金项目[院字（2015）4号]；遵义医学院与科技学院大学生创新训练项目[遵医科院（2015）3108]

563000贵州省遵义市，遵义医学院附属医院 儿内科（彭昌、李硕、谢新星、肖明晨）；遵义医学院 生理教研室（罗孝美）

彭昌 副主任医师 博士 主要从事心血管疾病研究 Email：pengchang_2006@126.com 通讯作者：彭昌

R54

A

1000-3614（2017）08-0803-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.08.017