TIMP-3启动子区基因多态性与动脉粥样硬化性脑梗死患病的相关性研究

孙祥荣，许 可，刘曙东

TIMP-3启动子区基因多态性与动脉粥样硬化性脑梗死患病的相关性研究

孙祥荣，许 可，刘曙东

目的 探讨基质金属蛋白酶抑制剂3(TIMP-3)启动子区基因多态性与动脉粥样硬化性脑梗死的关系。方法 选取2014年2月—2016年10月在我院治疗的脑梗死病人394例(病例组)，同时选取健康自愿者400名作为对照组。分析TIMP-3基因启动子区-915位点(rs2234921)多态性。结果 TIMP-3启动子区-915位点(rs2234921)PCR扩增片段经酶切后，有3种基因型，包括GG型、AG型和AA型；病例组和对照组基因型及等位基因频率分布比较差异有统计学意义(P<0.05)，病例组基因GG型和等位基因G比例分别为27.67%和50.38%，明显高于对照组(P<0.05)。结论 TIMP-3启动子区-915位点(rs2234921)多态性与动脉粥样硬化性脑梗死易感性有关，有望成为高危人群筛选标志以及干预靶点。

脑梗死；动脉粥样硬化；基质金属蛋白酶抑制剂3；基因多态性

动脉粥样硬化性脑梗死的发生发展，可以导致病人脑血管的阻塞，进而导致脑梗死或者脑出血的发生，临床预后较差。流行病学研究显示，动脉粥样硬化性脑梗死的发病率接近0.06%～0.16%，在部分地区的发病率可进一步上升[1]。 基础研究显示，基因水平的变化对于脑梗死的发生具有重要的影响，相关基因转录或者调节水平活性的改变，可以通过促进动脉粥样硬化内皮细胞的损伤，促进脂质或者泡沫细胞在动脉内皮组织中的沉积，导致动脉粥样硬化性心脑血管疾病的进展[2- 3]。基质金属蛋白酶抑制剂3(matrix metalloproteinase 3，TIMP-3)可以影响到动脉血管内皮组织中胶原成分的降解，促进单核细胞的浸润等，进而参与到脑梗死的发生过程中[4-6]。为了进一步揭示TIMP-3的基因多态性对于脑梗死发生的影响，本研究选取2014年2月—2016年10月在我院治疗的脑梗死病人394例，探讨TIMP-3启动子区基因多态性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年2月—2016年10月在我院治疗的脑梗死病人394例(病例组)，其中男性221例，女性173例；年龄43岁～84岁(65.40岁±8.79岁)。纳入标准：诊断符合缺血性卒中诊治指南中的相关标准[2]；均经头颅CT、MRI确诊；均为初次发病，相互间无血缘关系；病人及家属知情同意并签署同意书。排除标准：有症状性脑梗死、梗死后出血和脑出血；有系统性炎性疾病、自身免疫性疾病、甲状腺疾病、结核、肿瘤性卒中等。同时选取健康自愿者400名(对照组)，男性244名，女性156名，年龄41岁～82岁(64.84岁±10.22岁)。两组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 检测方法 取冻存的血清保存液体，按照10 000 r/min的离心速度进行离心分离，每1 mL的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2 mL的氯仿，进行裂解操作，4 ℃冰水采用无酶的RNA冲洗液进行洗涤，再次10 000 r/min离心5 min，得到RNA。混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3 min，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5 μL，37 ℃水浴60 min，室温放置5 min使其完全溶解，使其逆转录为cDNA。以β-actin为模版，在反应体系中加入SYBR Green 1 染料、上游引物、下游引物、dNTP，使得总体积达20 μL，上机，反应条件为：93℃2 min、93℃ 1 min。

2 结 果

2.1 基因型分析 TIMP-3启动子区-915位点(rs2234921)PCR扩增片段经酶切后，有3种基因型，包括GG型、AG型和AA型。详见图1。

注：M为DNA标记物；1，5为GG型；2，4为GA型；3为AA型

图1 电泳结果

2.2 Hardy-Weinberg平衡检验 病例组和对照组基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡检验，说明病例组和对照组样本具有代表性。详见表1。

表1 Hardy-Weinberg平衡检验

2.3 两组基因型及等位基因比较 病例组和对照组基因型及等位基因频率分布比较差异有统计学意义(P<0.05)，病例组基因GG型和等位基因G比例分别为27.67%和50.38%，明显高于对照组(P<0.05)。详见表2。

表2 两组基因型及等位基因分布比较 例(%)

3 讨 论

脑血管或者颈部动脉血管内皮的长期损伤，影响到了内皮细胞的正常代谢，导致脂质细胞、低密度脂蛋白或者三酰甘油的沉积，血管内皮的粥样硬化性改变较为明显，血管的狭窄较为严重。一项汇集了192例样本量的临床随访研究显示，动脉粥样硬化导致的脑梗死发生占到了各种病因脑梗死的35%以上，且其病情进展较为迅速，病人病死率较高，远期致残率或者生存预后较差[7-8]。而对于脑梗死病人相关基因表达水平的生物学标志物研究，可以为动脉粥样硬化性脑梗死的基因治疗提供理论依据，并可以为揭示脑梗死的发病机制提供参考。

TIMP-3作为蛋白酶抑制剂家族成员，其持续性的活化或者转录翻译蛋白的上调，在影响到动脉血管内皮的过氧化损伤、加剧细胞炎症因子的浸润，黏附低密度脂蛋白等方面，均发挥了一定的促进作用。TIMP-3的启动子水平的多态性演变，在调控下游转录活性，影响到沉默子的表达等方面具有一定的作用，最终可以影响到TIMP-3蛋白的表达参与到多种生物进程中[9- 10]。TIMP-3在心肌梗死、脑梗死等心脑血管疾病的发生中具有一定的积极作用，已有研究探讨了TIMP-3在促进急性冠脉综合征发生中的作用，认为高表达的TIMP-3可以加剧病人心肌细胞的缺血程度[11-12]，但对于TIMP-3多态性在脑梗死中的研究不足。两组病例中的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡检验，提示两组基因型表达中G及A位点的表达符合正太分布规律，无异常突变导致的临床资料的选择偏倚产生，提示了本次研究的科学性。

在本次研究中， TIMP-3扩增后进行分析，可以发现其主要包括3种基因型，GG型、AG型和AA型，提示G基因型的表达或者A基因型的可能是促进 TIMP-3对于动脉粥样硬化发生的主要因素，G基因型的表达或者A基因型多态性位点的变化，可以在影响到TIMP蛋白羧基末端的转录活性，改变其四级空间结构的修饰，或者通过磷酸化进而影响到TIMP的生物活性，加剧其对于粥样硬化发生的促进作用。郑周等[13-14]前瞻性收集分析研究了82例样本，发现G基因型的异常表达或者等位位点的异常，是加剧脑梗死病人脑组织缺血性坏死的重要因素，且G基因型的位点突变效应越为明显，脑梗死病人远期的生存预后越差，相关性较为显著，这与本研究的结论较为相似。另外，更为重要的是，在分析不同等位基因的表达过程中，本研究发现病例组基因GG型和等位基因G比例分别为27.67%和50.38%，均明显高于其他基因型，特别是A基因型或者等位基因，提示GG或者G等位基因的表达，是促进粥样硬化性脑梗死发生的风险因素，GG或者G等位基因的表达可以在下列因素方面影响到脑梗死的发生：①GG或者G等位基因的高表达，加剧了TIMP-3蛋白对于Ⅳ型胶原纤维蛋白的降解作用，影响到了动脉血管的中层结构，导致血管容易发生破裂出血或者栓塞；②GG或者G等位基因在抑制启动子序列中不同可转录区的活性上，具有显著的影响，持续性的启动子区域的激活效应，上调了下游脂质代谢紊乱的可能性，特别是低密度脂蛋白的代谢异常可以进一步影响到脑梗死的发生。

综上所述，TIMP-3启动子区-915位点(rs2234921)多态性与动脉粥样硬化性脑梗死易感性有关，有望成为高危人群筛选标志以及干预靶点。

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(本文编辑王雅洁)

川北医学院附属医院( 四川南充 637099)，E-mail：yangshuangyanoi@163.com

信息：孙祥荣，许可，刘曙东.TIMP-3启动子区基因的多态性与动脉粥样硬化性脑梗死患病的相关性研究[J].中西医结合心脑血管病杂志，2017，15(15)：1930-1932.

R743.33 R255.2

B

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.15.040

1672-1349(2017)15-1930-03

2017-06-08)