Exendin-4对淀粉样 β 蛋白所致大鼠学习记忆和海马神经元胞内钙离子的影响

潘艳芳，方 艳，应小平

Exendin-4对淀粉样 β 蛋白所致大鼠学习记忆和海马神经元胞内钙离子的影响

潘艳芳，方 艳，应小平

目的 探讨Exendin-4对淀粉样 β 蛋白( Aβ1- 42)所致大鼠学习记忆及对大鼠海马神经元细胞内钙离子浓度的影响。方法 SD雄性大鼠( n= 40)分为对照组、Aβ1- 42、Exendin-4、Exendin-4 + Aβ1- 42等4组。双侧海马注射 Aβ1- 42 建立阿尔茨海默病(AD)模型，Exendin-4预处理后进行Morris水迷宫实验检测大鼠的学习记忆能力， 利用激光扫描共聚焦显微成像技术检测海马神经元细胞内钙离子[Ca2+]i荧光强度。结果 与对照组相比， 海马单独注射 Aβ1- 42 可导致大鼠学习记忆能力明显下降( P<0.05)；单独注射Exendin-4不影响大鼠的学习记忆， 但Exendin-4预处理可有效逆转 Aβ1- 42 引起的学习记忆损伤(P>0.05)；Exendin-4预处理逆转了Aβ1- 42引发的海马神经元细胞内Ca2+的浓度增高(P<0.05)。结论 Exendin-4可有效拮抗 Aβ1- 42 所致的大鼠空间学习记忆伤害，作用机制可能通过调节AD模型大鼠海马神经元细胞内钙离子稳态。

阿尔茨海默病；Exendin-4； 淀粉样 β 蛋白；学习记忆； 细胞内钙浓度

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease， AD)是一种神经退行性疾病，其特征性病理改变为脑内出现淀粉样β蛋白(Amyloid β protein，Aβ)沉积，神经细胞内出现神经元纤维缠结(NFTs)、大量的神经元丢失与脑萎缩[1]。 Aβ是老年斑的主要成分， 其来源于淀粉样前体蛋白(APP)在 γ 和 β 分泌酶的作用下裂解而成的一个多肽，具有广泛的神经毒性[2]。然而目前仍缺乏有效的AD治疗手段。 近年来流行病学调查表明，AD与2型糖尿病(T2DM)的发生具有密切的相关性[3]。T2DM 病人罹患 AD 的概率比正常人高出两倍，85%的 AD 病人同时伴发有T2DM 或血糖水平的明显升高[4]。近年来提出的一个治疗 AD 的新策略就是：利用抗 T2DM 的药物干预 AD。目前，这方面的研究已经有一定进展。胰高血糖素样肽-1(GLP-1)及其类似物能够减少 Aβ的沉积和Tau蛋白磷酸化，改善线粒体功能，抑制炎症反应和促进神经元生长，从而使AD病人的认知功能得到改善[5]。Exendin-4是一个GLP-1的类似物，与GLP-1受体结合后，导致细胞内环磷酸腺苷(cAMP)增加、钙离子浓度升高，促进胰岛素出胞，从而葡萄糖依赖性降低血糖上调。研究进一步显示， AD小鼠侧脑室灌注 Exendin-4后全脑匀浆Aβ水平明显下降，并能逆转Aβ导致的海马神经元凋亡[6]； 这提示， Exendin-4对Aβ可能具有强大的中枢拮抗效应。本研究探讨Exendin-4发挥的神经保护作用是否通过调节细胞内钙离子的稳态来实现。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂 成年雄性 Sprague-Dawley (SD)大鼠230 g～250 g， 由西安交通大学实验动物中心提供。将40只大鼠随机分为4组，每组10只 ： control、 Aβ1-42 (3 nmoL)、Exendin-4(2 nmoL)和 Aβ1-42+ Exendin-4。Exendin-4 和Aβ1- 42均购置美国 Sigma 公司。Exendin-4 和Aβ1- 42经微量二甲基亚砜 ( DMSO) 充分溶解后， 用磷酸盐缓冲液( phosphate buffered saline， PBS) 稀释。Aβ1-42 在 37 ℃下孵育 72 h， 间断振荡，使其老化成寡聚体。各组大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉 (300 mg/kg) 麻醉后， 固定于脑立体定位仪(68004， 瑞沃德公司 )上。 切开头皮，暴露颅骨，参照大鼠脑立体定位图谱，以前囟点 为基准， 用骨钻于钻孔， 将自制的不锈钢给药导管插入大鼠双侧海马 CA1 区后3.0 mm、 中线旁开 2.2 mm、 深度 3.0 mm， 再利用微量注射泵 (KD Scientific， Inc， KDS 310 Plus， USA) 和 5 μL微量注射器将药物或溶剂 ( 2 μL)缓慢注入双侧海马，给药速度 0.2 μL/min。药物注射完后留针 5 min， 药物注射间隔 15 min。注射药物后，颅骨上的注射孔用骨蜡封口、 皮肤缝合并给予抗生素处理。恢复1周后开始水迷宫试验。

1.2 Morris水迷宫测试 大鼠被放置在一个直径为 150 cm、 深度为 50 cm的水迷宫宫体中，水温保持在(23±2) ℃，让其寻找一个比水面低1 cm 的水下平台 ( 直径 14 cm、 高 29 cm)。水池内表面与平台均涂成黑色。所有大鼠的活动和轨迹通过水池正上方固定的摄像头进行监视并把信号用行为学分析软件系统 (Ethovision 3.0， Noldus Information Technology， Netherlands) 进行处理。全部测试包括三个方面：定位航行试验、空间探索试验和可视平台试验。主要观察指标有：大鼠找到水下平台的平均逃避潜伏期和平均逃避距离、撤除平台后大鼠在目标象限内的游泳时间和距离百分比以及游泳速度等。

1.3 海马原代神经元培养 取新生SD大鼠，无菌条件下剪开头皮、颅骨，用弯镊拉开脑区视野，小心取出全脑，D-hanks液洗数次，以脑中线为起点，小心拨开大脑颞叶皮层，小心夹出海马组织，置于冰浴的D-hanks液中，仔细剔除微血管，大脑海马剪成米粒大碎片， 以终浓度为 0.125%的胰蛋白酶消化( 37 ℃，20 min)，用含胎牛血清的培养基终止消化， 用尖头吸管轻轻吹打细胞10～20 次数分钟，至液体成米糊状即停止吹打， 用150目网筛过滤， 滤后1 000 r/min 离心5 min， 弃上清， 用DMEM/F12培养液重悬细胞， 调整细胞密度为 1×106/mL， 种植于预先用多聚赖氨酸液包被的 35 mm 培养皿中， 在 37 ℃、饱和湿度并通有 5% CO2的孵箱中培养。接种后24 h将培养液换成含B27的无血清Neurobasal培养液， 48 h 后加入 10 μmol/L 的阿糖胞苷以抑制非神经元细胞的增殖， 以后每3 d半量换液。

1.4 激光共聚焦显微镜钙测定 取培养7 d后的海马神经细胞， 对Exendin-4对照组及联合给药组进行Exendin-4预处理 24 h后，用PBS溶液洗涤3 次， 加入 Fluo-4/AM (5 μmol/L) 在37 ℃下负载30 min荧光染料，负载结束后， 用生理盐溶液洗去细胞外多余染液。然后置于激光共聚焦倒置显微镜(日本OLYMPUS，FV-1000)下动态检测对[Ca2+]i对急性给予 Aβ1-42 的反应。

2 结 果

2.1 Exendin-4保护大鼠学习记忆免受 Aβ1- 42 引起的损伤 在定位航行试验中，随着训练天数的增加，对照组和各处理组大鼠寻找平台所需要的时间(图1A)和所游过的距离(图1B)均逐渐减少。除训练第 1 天外， Aβ1-42组大鼠的游泳距离在2 d～5 d与对照组相比，均明显增加(P<0.05)。单独给予2 nmoL Exendin-4 没有明显影响(P>0.05)，但是与单独给予Aβ1-42组相比，在2 d～5 d，2 nmoL Exendin-4+Aβ1-42组大鼠寻找平台距离均明显降低(P<0.05)。图1C图1D 显示了第 6 天进行的空间探索试验结果。对组照大鼠在目标象限内停留百分比(45.62±2.72)%和距离百分比(44.71± 1.94)%，给予 Aβ1-42 的大鼠在目标象限内停留百分比(27.78± 2.54)%和游泳距离的百分比(29.13± 2.37)%，均较对照组明显缩短(P<0.05)。单独Exendin-4大鼠在目标象限中花费的时间百分比(45.71± 1.84)%和游过距离占游泳总距离的百分比为(44.42 ± 1.93)%， 与对照组相比无统计学意义 (P>0.05)。而2 nmoL Exendin-4+Aβ1-42组在目标象限内停留的时间占总时间的百分比(36.94 ± 2.51)%和游泳距离占游泳总距离的百分比分别为 (35.68 ±2.72)%，较单独 Aβ1-42 处理组明显增加 (P<0.05)。以上结果表明， Exendin-4 单独注射不影响大鼠的空间学习记忆功能， 但 Exendin-4预处理却拮抗 Aβ1-42 引起的学习记忆伤害。详见图1。

图1 Exendin-4阻止Aβ1-42引起的大鼠空间学习记忆伤害

2.2 Aβ1-42和Exendin-4对大鼠的视力及速度的影响 为了排除药物对大鼠速度及视力的影响，在Morris 水迷宫实验中检测了各组大鼠的游泳时间，在可视平台试验中检测了大鼠到达可视平台所需时间。 各处理组大鼠平均游泳速度和寻找平台潜伏期之间均无明显差异。详见图2。药物处理对大鼠行为学的影响不是通过影响视力和运动功能而实现的。

图 2 海马内注射Exendin-4和Aβ1-42不影响大鼠的视力和运动能力

2.3 Exendin-4预处理拮抗了Aβ1-42引起的钙超载 为了检测Exendin-4拮抗Aβ1-42对学习记忆的伤害是否和调节细胞内钙离子稳态有关系。本研究比较了不同处理对海马神经元细胞内钙离子浓度的影响。与对照组相比(100.0±5.1)%， 10 μmoL Aβ1-42加入后，细胞内相对荧光密度增加到(228.1±6.7)%(P<0.05)。加入 200 nmoL Exendin-4后，相对荧光密度与对照组相比无统计学意义(P>0.05)，但是在Exendin-4 (200 nmoL)预处理却能够抵抗Aβ1-42引起的荧光密度的增加。因此表明Exendin4发挥神经保护作用可能和调节细胞内[ Ca2+]i稳态有关。详见图3。

图3 Exendin-4预处理拮抗了Aβ1-42引起的钙超载

3 讨 论

双侧海马注射 Aβ1-42 可引起大鼠空间学习记忆功能损伤 ；这一过程可能涉及细胞内[ Ca2+]i稳态的打破[7]。Exendin4 预处理可能通过调节[ Ca2+]i的平衡拮抗 Aβ1-42 引起的学习记忆伤害。钙离子是一个关键的细胞信转导号分子，在细胞增殖、神经兴奋性、突触传递、基因转录过程中起重要作用Ca2+参与突触传递神经递质释放，以及神经元兴奋性和突触可塑性调节[7]。细胞内钙稳态的扰乱诱导了许多神经系统疾病， 包括AD、脑卒中和帕金森病[8]。一些研究表明，细胞内正常浓度范围的Ca2+能够保持神经元的兴奋性。钙超载可以降低神经元兴奋阈值，导致神经元凋亡[9]。还有研究表明，钙稳态破坏和神经炎症可导致认知功能和突触功能下降，且在衰老细胞中有过量的Ca2+。异常钙调节是参与到AD的病理过程。调制钙平衡可以提供潜在的方法预防和逆转AD。

Aβ在AD发病早期起着重要作用。Aβ可以通过许多机制诱导神经毒性，如钙稳态的打破，氧化应激和神经毒性； 然而，细胞内钙平衡的破坏被认为是最重要。已经有研究表明，细胞内钙超载会导致神经细胞死亡，而Aβ25-35能够引起原代培养海马神经元的钙超载和学习和记忆损害[10]。本研究发现Aβ1-42能够引起原代培养海马神经元的钙超载和学习和记忆损伤。

近年来，有研究发现治疗2型糖尿病的药物可改善AD病理变化。GLP-1能够发挥神经保护作用和提高学习记忆功能，但是天然的GLP-1只有(1～2)

min的半衰期，从而导致了其临床应用的有限性。有幸的是，Exendin4拥有一个较长的半衰期(60～90 min)，且能发挥神经保护作用，刺激轴突生长，阻止兴奋毒作用和氧化应激[11]。本研究显示：与单独Aβ1-42相比，给予Exendin4能够降低海马神经元细胞内Ca2+的水平，这一过程极可能参与到Exendin4拮抗Aβ1-42导致的学习记忆功能伤害过程中。因此Exendin4可能用于AD的预防和治疗中。

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(本文编辑王雅洁)

Effects of Exendin-4 on Amyloid β-protein Induced Impairments of Learning Memory and Intracellular Calcium Concentration of Hippocampal Neuron in Rats

Pan Yanfang，Fang Yan，Ying Xiaoping

School of Basic Medical Science， Shaanxi University of Chinese Medicine， Xianyang 712046， Shaanxi，China

Objective To explore the effects of exendin-4 on amyloid β-protein (Aβ) 1-42-induced deficits in learning memory and intracellular calcium concentration of hippocampal neuron in rats.Methods Forty male Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into four groups (n=10，each group):control， Aβ1-42 ， Exendin-4， Exendin-4+Aβ1-42.After bilateral hippocampal injection of Aβ1-42 and exendin-4 rats，Morris water maze test was used to test the ability of spatial learning and memory，and laser-scanning confocal calcium imaging technique was used to test the [Ca2+]i in primary cultured rat hippocampal neurons.Results Hippocampal injection of Aβ1-42 alone impaired spatial learning and memory of rats (P<0.05).Exendin-4 did not affect learning and memory of rats，but alleviated Aβ1-42-induced spatial learning and memory deficits，compared with Aβ1-42 alone group (P>0.05).Pretreatment with exendin-4 suppressed Aβ1-42-induced elevate on in intracellular calcium concentration [Ca2+]i.(P<0.05).Conclusion These findings indicate that systemic pretreatment with exendin-4 can effectively prevent the impairment in spatial learning and memory of rats induced by neurotoxic Aβ1-42， and the underlying protective mechanism of exendin-4 may be involved in regulation of calcium homeostasis.

Alzheimer’s disease；exendin-4；amyloid β-protein；spatial learning and memory;intracellular calcium concentration

陕西省自然科学基础研究计划(No.2015JQ8299)

陕西中医药大学基础医学院病理教研室( 陕西咸阳 712046)

信息：潘艳芳，方艳，应小平.Exendin-4对淀粉样 β 蛋白所致大鼠学习记忆和海马神经元胞内钙离子的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志，2017，15(15)：1834-1837.

R749.1 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.15.006

1672-1349(2017)15-1834-04

2016-08-03)