益气活血中药对急性心肌梗死后大鼠心肌线粒体生物合成相关蛋白的影响

闫会晶，刘剑刚，董瑞红，张大武，王承龙

·基础医学论著/研究·

益气活血中药对急性心肌梗死后大鼠心肌线粒体生物合成相关蛋白的影响

闫会晶，刘剑刚，董瑞红，张大武，王承龙

目的 观察益气活血中药西洋参茎叶总皂苷(PQS)和精制血府胶囊配伍对急性心肌梗死(AMI)大鼠心肌AMPK活化的线粒体生物合成相关蛋白的影响。方法 SD雄性大鼠60只，高脂饲料喂养28 d，4%水合氯醛麻醉后，结扎冠状动脉前降支造成AMI模型，成活大鼠共26只，随机分为模型组和益气活血组，每组13只；并设假手术组(只穿刺，不结扎)13只。术后2 d开始灌胃药物，益气活血药液中包含了PQS和精制血府浸渍膏，药物灌胃剂量为PQS 162 mg/ (kg·d)，精制血府3.6 mg/ (kg·d)，模型组和假手术组大鼠灌胃等量的蒸馏水。灌胃28 d后，将大鼠麻醉，行超声心动图检测，测定大鼠左室收缩末内径(LVDs)、左室舒张末内径(LVDd)、射血分数(EF)。完成后，打开大鼠胸腔，取出心脏，进行心肌病理组织学检测及心肌组织内AMP激活蛋白激酶ɑ2(AMPKɑ2)、过氧化物酶体增生物激活的受体γ共激活因子1ɑ(PGC1ɑ)基因和蛋白的测定。结果 心脏超声结果显示：与假手术组相比，模型组大鼠LVDs、LVDd值显著增大(P<0.05)，EF值显著下降(P<0.05)；与模型组相比，益气活血组大鼠LVDs、LVDd值均降低(P<0.05)，EF值升高(P<0.05)。RT-PCR结果显示：与假手术相比，模型组大鼠心肌组织内AMPKɑ2、PGC1ɑ基因表达下调(P<0.05)；与模型组相比，益气活血组心肌组织内AMPKɑ2、PGC1ɑ基因上调(P<0.05)。Western结果：与假手术相比，模型组大鼠心肌组织内AMPKɑ2、PGC1ɑ蛋白表达下调(P<0.05)；与模型组相比，益气活血药物组心肌组织内AMPKɑ2、PGC1ɑ蛋白表达上调(P<0.05)。结论 益气活血中药可改善AMI后左室功能，抑制AMI后左室重构，该作用可能与促进线粒体生物合成蛋白(AMPKɑ2、PGC1ɑ)的表达有关。

急性心肌梗死；益气活血；模型大鼠；AMP激活的蛋白激酶；过氧化物酶体增生物激活的受体γ共激活因子1ɑ

急性心肌梗死(AMI)后，梗死血管所供应的心肌组织因缺血、缺氧而凋亡、坏死，心肌缺血坏死后，局部心肌组织变薄，功能降低甚至丧失，非坏死部位心肌代偿性肥厚，称为心室重构，这与心力衰竭和死亡密切相关。减少心肌坏死，抑制梗死后心室重构和改善梗死后左室功能已成为目前AMI后内科药物治疗的目标。线粒体是能量代谢的重要场所，线粒体数量的增加可从长远意义上促进有氧氧化产能。

心悦胶囊主要成分为西洋参茎叶总皂苷(Panax quinquefolius Saponin，PQS)，是从西洋参茎叶中提取出的有效成分，前期实验研究表明，PQS通过维持缺血再灌注期线粒体膜电位的稳定性，抑制心肌线粒体凋亡通路，抑制过度内质网应激等，降低缺血再灌注引起的心肌损伤[1-2]，抑制AMI后大鼠心室重构，减轻原代心肌细胞培养过程中毒胡萝卜素诱导的心肌细胞凋亡[3-4]。

精制血府胶囊又称气血并治方，其主要成分为柴胡、赤芍、川芎、枳壳，由经典的中药方剂血府逐瘀汤加减化裁而来。临床研究显示，精制血府胶囊具有轻度消减斑块、调节脂代谢、抗血小板聚集及干预炎症反应的作用，并且研究过程中未见明显安全性问题[5-8]。

1 材料与方法

1.1 实验动物 Spraque-Dawley(SD)大鼠60只，雄性，清洁级，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，合格证号：SCXK(京)2009-0007，体重140 g～160 g，清洁级动物室喂养，动物室内湿度50%～70%，温度(23～25)℃，大鼠食饮自由，光照、黑暗各半，适应性喂养普通饲料一周后，给以高脂饲料喂养(4%胆固醇，0.5%胆酸钠，0.2%丙硫氧嘧啶，10%猪油和维生素D31.25×10 U/kg，85.3%基础饲料)，喂养高脂饲料28 d后开始造模。

1.2 实验器材 H-600型电子纤维镜，日本日立公司。OLYMPUS型光学显微镜，日本奥林巴斯公司；SIEMENS ACUSON Sequoia型超声诊断仪，15L8W型高频线阵探头，西门子公司；QL-902型斡旋振荡仪，海门市其林贝尔仪器制造有限公司生产；Centrifuge 5415D型离心机，Eppendorf公司；NANODROP 2000型分光光度计，Therno scientific公司；ABI7500型荧光定量PCR仪，Applied Biosystems公司；Fresco低温冷冻离心机，Thermo公司；MultiSkan3酶标仪，Thermo公司；Mini P-4电泳槽，Cavoy公司；湿转电泳槽，Cavoy公司；电泳仪，Bio-Rad公司；水平脱色摇床，其林贝尔公司；酸度计 pH211，Hanna公司；电动组织匀浆器，Fluka。

1.3 药物与试剂 心悦胶囊主要成分为西洋参茎叶总皂苷0.3 g(相当于西洋参茎叶总皂苷50 mg)，批号：100606，国药准字：Z20030073，由吉林省集安益盛药业股份有限公司，按162 mg/(kg·d)灌胃。精制血府胶囊为柴胡、川芎、赤芍、枳壳全方水提取物，为浸膏制剂，4.94 g生药/kg，提取率为52.78%，由中国科学院大连化学物理研究所提供，按3.6 mg/ (kg·d)灌胃。TRNzol总RNA提取试剂，货号：DP405-02，天根生化科技(北京)有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，货号：RR047B，TaKaRa(宝生物)；SYBRPremix Ex TaqTMII(TliRNaseH Plus)，ROX plus，货号：RR82LR，TaKaRa(宝生物)；DL2，000 DNA Marker，货号：3427Q，TaKaRa(宝生物)；Rabbit AMPKɑ2，货号：ab3760，abcam公司；Rabbit PGC1ɑ，货号：ab54481，abcam公司。

1.4 大鼠急性心肌梗死模型建立 即将用于造模的大鼠禁食12 h，称重，用4%的水合氯醛(注射量按0.9 mL/100 g体重计算)腹腔注射，用剪刀竖直剪开左侧胸部皮肤，钝性分离胸骨左侧第3～4肋间肌肉组织，左手中指以巧力挤压右胸，快速挤出心脏，找到左心耳，并将左心耳翻开，距肺动脉圆锥与左心耳分支起点处(1～2) mm用0号丝线结扎前降支，迅速将心脏放回胸腔，尽量挤出胸腔内的气体，缝合皮肤前，在缝合部位撒上适量的青霉素粉末，预防术后感染，若有出血者，撒入适量的云南白药粉末止血，缝合皮肤。假手术组操作同上，但只穿刺不结扎。术后第二天开始，手术后的大鼠给予青霉素4×104U/d，腹腔注射，连续3 d，预防术后感染。

1.5 动物分组及用药 共制作AMI模型大鼠26只，随机分为两组，模型组和益气活血组，各13只。并设假手术组13只。用蒸馏水配制干预药物，益气活血药液中包含了PQS和精制血府浸渍膏，从术后第2天开始给药，灌胃剂量为PQS 162 mg/(kg·d)，精制血府3.6 mg/(kg·d)，模型组和假手术组分别给予等量的蒸馏水灌胃，连续灌胃4周。

1.6 观察指标

1.6.1 大鼠心脏结构和功能 灌胃4周后，大鼠禁食12 h，称重，将麻醉后的大鼠固定在手术台上，用8%硫化钠溶液脱去大鼠左侧胸部毛发，将高频线阵探头置于左侧胸前部心脏搏动区，在观察到满意的左心室二维图像后，获取左室收缩末内径(LVDs)、左室舒张末内径(LVDd)和射血分数(EF)。

1.6.2 心肌病理学观察 从各组取3只心脏，置于10%甲醛溶液内保存24 h，梯度浓度乙醇脱水，用二甲苯透明处理，随后石蜡包埋，连续切片，切片厚度5 μm，将切片置于多聚氯氨酸处理过的防脱载玻片上，根据试剂盒说明，脱蜡脱水后，进行苏木精-伊红(HE)染色，梯度乙醇脱水，透明处理，中性树胶封固，用以光镜观察。

同时在每组大鼠左心室同一部位(心尖右侧)取大小1 mm×1 mm×1 mm的组织块，每组取1块，于2.5% 戊二醛溶液内固定，置于4℃冰箱保存24 h后，用磷酸盐缓冲液冲洗3次，饿酸固定2 h后，再次用磷酸盐缓冲液冲洗3次，随后用5种浓度的乙醇溶液对样品进行脱水处理，经干燥和离子喷涂后，置于电子显微镜下观察。

1.6.3 RT-PCR分析 将大鼠心脏冠脉结扎部位以上组织去除，另剪去右心室，保留左心室，锡纸包裹，液氮快速冷存，将液氮冷冻后的心室组织置于-70 ℃冰箱中保存，每组分别取5只，用TRNzol总RNA提取试剂提取样本RNA，用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度；采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser进行cDNA反转录；用ABI 7500型荧光定量PCR仪，采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析，定量各心肌组织内AMPKɑ2和PGC1ɑ的基因表达。引物设计见表1。

表1 引物设计

1.6.4 Westren blotting分析 提取心肌总蛋白，BCA法定量蛋白后，调整蛋白浓度，使蛋白终浓度为4 mg/mL，根据目的蛋白分子量配制分离胶和浓缩胶，上样，电泳，湿转法转膜，封闭，一抗孵育，洗膜，二抗孵育，其中，一抗AMPKɑ2和PGC1ɑ稀释比例均为1∶1 500，ECL加到膜上反应3～5 min，胶片曝光：10 s至5 min(曝光时间随不同光强度而调整)，显影2 min，定影。

2 结 果

2.1 益气活血中药配伍对AMI大鼠心脏超声的影响 心脏超声结果显示：与假手术组相比，模型组大鼠LVDs、LVDd值显著增大(P<0.05)，EF值显著下降(P<0.05)，说明AMI模型大鼠制作成功；与模型组相比，益气活血组大鼠LVDs、LVDd值均降低(P<0.05)，EF值升高(P<0.05)。详见表2。

表2 益气活血中药配伍对AMI大鼠心脏超声的影响(±s)

2.2 益气活血中药配伍对AMI大鼠心肌组织病理学的影响 光学显微镜观察心肌病理组织：与假手术组相比，模型组心肌细胞排列紊乱，细胞间质充血水肿；与模型组相比，益气活血组心肌细胞排列整齐，细胞间质未见明显水肿。详见图1。

注：A为假手术组；B为模型组；C为益气活血组。

图1 光学显微镜观察心肌病理组织

电子显微镜观察心肌细胞超微结构，与假手术组相比，模型组心肌细胞内肌原纤维排列紊乱，大量线粒体结构被破坏。与模型组相比，益气活血组心肌细胞内胶原纤维排列整齐，线粒体数量多，结构完整。详见图2。

注：A为假手术组；B为模型组；C为益气活血组。

图2 电子显微镜观察心肌细胞超微结构结果

2.3 益气活血中药配伍对AMI大鼠心肌线粒体生物合成相关基因的影响 RT-PCR结果显示：与假手术组相比，模型组大鼠心肌组织内AMPKɑ2、PGC1ɑ基因表达下调(P<0.05)；与模型组相比，益气活血组大鼠心肌组织内AMPKɑ2、PGC1ɑ基因上调(P<0.05)。详见表3。

表3 益气活血中药配伍对AMI大鼠心肌线粒体生物合成相关基因的影响(±s)

2.4 益气活血中药配伍对AMI大鼠心肌线粒体生物合成相关蛋白的影响 Western结果：与假手术相比，模型组大鼠心肌组织内AMPKɑ2、PGC1ɑ蛋白表达下调(P<0.05)；与模型组相比，益气活血药物组心肌组织内AMPKɑ2、PGC1ɑ蛋白表达上调(P<0.05)。详见表4。

表4 益气活血中药配伍对AMI大鼠心肌线粒体生物合成相关蛋白的影响(±s)

3 讨 论

急性心肌梗死后，很有可能发生梗死部位的扩展和左室的重构，主要表现为梗死部位的变薄和扩张，梗死区和非梗死区左室形态和功能的变化，这与心力衰竭和死亡密切相关。根据文献报道，左室重构的表现较正常LVDd增加10%以上者即为左室重构[9]。在本实验中，与假手术组相比，模型组大鼠LVDd是假手术组的1.86倍(P<0.05)，显示模型组大鼠表现出典型的左室重构，益气活血药物干预后，大鼠LVDd值较模型组下降了39.8%(P<0.05)，益气活血中药可显著抑制AMI后左室重构。EF代表了左室收缩功能，是评估心功能的重要指标，本实验显示，益气活血中药可显著改善AMI后心功能。

AMPK是一个含有ɑ、β和γ亚基的异三聚体复合物，是真核细胞内重要的能量感知器。中重度的代谢压力，一些药物(如二甲双胍[10]、苯乙双胍[11]等)，以及细胞内活性氧的增多(reactive oxygen species，ROS)都能激活AMPK[12]。激活后的AMPK可通过多种途径提高细胞内能量水平，如抑制蛋白、脂肪等的合成，促进碳氢化合物分解产生ATP[13-14]。有研究显示，在心肌缺血时，AMPK可保护缺血心肌细胞，减少心肌细胞损伤[15]。但当细胞内活性氧持续增多时，又可通过钙调神经磷酸酶抑制AMPK活性[16]。

AMPK可通过提高细胞内能量水平来缓解各种代谢压力对机体的损害；短暂的活性氧浓度升高，以及一些药物等可促进AMPK的激活从而促进细胞内能量代谢；长期的活性氧积累可抑制AMPK活性。本实验研究显示，AMI后，当未给予任何药物干预时，由于细胞内过氧化物持续积累，使得细胞内AMPK基因和蛋白表达显著下调，益气活血中药干预后，心肌细胞内AMPK基因和蛋白的表达量较模型组明显上调，表明益气活血中药可促进AMI后心肌细胞内AMPK的表达。

AMPK还有一个重要的作用，即促进线粒体生物合成，这与AMPK调节PGC1ɑ的表达有关[17]，AMPK的这一作用，可从长远意义上促进葡萄糖和脂肪酸氧化分解产能。PGC1ɑ是线粒体生物合成的关键调节因子，在生理条件下，其对于各种环境变化非常敏感，温度、能量状态和各种生理活动均可引起其表达量的改变，它对于维持糖、脂代谢和能量平衡起着重要的作用，并且参与某些病变的发生和发展。心脏对能量的需求极高，正常心肌组织内表达着大量的PGC1ɑ。有研究显示，心脏病变，如心力衰竭时，心肌细胞内能量代谢的降低主要表现为心肌细胞内底物有氧氧化降低，而这种变化与心肌细胞内PGC1ɑ表达明显降低有关[18]。

在生理条件下，机体能量需求增多时，PGC1ɑ表达上调，促进线粒体生物合成、有氧氧化产生ATP；在病理条件下，细胞内代谢底物如葡萄糖、脂肪酸的含量明显不足时，细胞内PGC1ɑ表达下调。本实验结果显示，AMI后，未给予药物干预时，心肌处于缺血缺氧状态，细胞内代谢底物明显不足，使得PGC1ɑ表达量下调，通过益气活血药物干预后，细胞内PGC1ɑ表达上调。 本实验结果中，AMI后AMPK、PGC1ɑ的表达均显著下调，而益气活血药物干预后，心肌组织内AMPK、PGC1ɑ的表达显著上调。益气活血中药对AMI大鼠心脏的保护作用可能与促进AMPK活化的线粒体生物合成有关。

益气活血中药可改善AMI后左室功能，抑制AMI后左室重构，该作用可能与促进线粒体生物合成蛋白(AMPKɑ2、PGC1ɑ)的表达有关。

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(本文编辑王雅洁)

Effect of Strengthing Qi and Activating Blood Chinese Medicine on Myocardial Mitochondrial Biogenesis Related Protein in Rats after Acute Myocardial Infarction

Yan Huijing， Liu Jiangang， Dong Ruihong， Zhang Dawu， Wang Chenglong

Cardiovascular Disease Center， Xiyuan Hospital Affiliated to China Accademy of Chinese Medical Sciences;Heart Institute of China Accademy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100091，China

Corresdonding Author:Wang Chenlong

Objective To observe the effect of strengthing qi and activating blood Chinese medicine Panax quinquefolius saponin (PQS) and refined Xuefu Capsules on AMPK activated- mitochondrial biogenesis protein in rats myocardium after acute myocardial infarction (AMI).Methods Sixty male Sprague-Dawley (SD) rats， fed with high-fat diet for 28 d， after anesthetized with 4% chloral hydrate， 26 of them were made as AMI model successfully by descending artery ligation.And all of AMI model rats were randomly divided into model group， strengthing qi and activating blood Chinese medicine group， for 13 rats in each group.And set 13 rats as sham group (only puncture，without ligation) .The rats of strengthing qi and activating blood Chinese medicine group were gavaged with the strengthing qi and activating blood Chinese medicine， with PQS was given 162 mg/(kg·d)，refined Xuefu capsules was given 3.6 mg/(kg·d) since the next day of surgery.At the same time， the rats of model group and sham group are gavaged with equal amount of distilled water.After 28 d， the rats were anesthetizedto measure left ventricular end-systolic inner diameter(LVDs)， left ventricular end-diastolic diameter(LVDd)， ejection fraction(EF)by Ultrasonic echocardiography.When finished， the chest was opened， and the hearts was removed for histopathology testing and the gene and protein of AMP-activated protein kinase ɑ2 (AMPKɑ2)， Peroxisome proliferator-activated receptor-γ co-activator1ɑ (PGC1ɑ) in rats myocardium testing.Results Echocardiography showed that compared with sham group， LVDs and LVDd value in model group significantly increased (P<0.05) and EF values decreased significantly(P<0.05).Compared with the model group， the LVDs and LVDd value in strengthing qi and activating blood Chinese medicine group reduced obviously (P<0.05) and EF value in strengthing qi and activating blood Chinese medicine group increased obviously (P<0.05).RT-PCR showed that compared with sham group， AMPKα2 and PGC1α genes of myocardial tissues in model group down-regulated (P<0.05).Compared with the model group， AMPKα2 and PGC1α genes of myocardial tissues in strengthing qi and activating blood Chinese medicine group up-regulated (P<0.05).Western Blot showed that compared with sham group， protein expression of AMPKα2 and PGC1α of myocardial tissues in model group down-regulated (P<0.05).Compared with the model group， protein expression of AMPKα2 and PGC1α of myocardial tissues in strengthing qi and activating blood Chinese medicine group up-regulated (P<0.05).Conclusion Strengthing qi and activating blood Chinese medicine can inhibit left ventricular remodeling， and improve left ventricular function after AMI.The role of protection may related to the promotion of mitochondrial biogenesis protein (AMPKα2 and PGC1α) expression in myocardium after AMI.

acute myocardial infarction；supplementing qi and activating blood；model rats；AMP-activated protein kinase；peroxisome proliferator-activated receptor-γ co-activator 1α

国家自然科学基金面上项目(No.81273934)

中国中医科学院西苑医院心血管病中心/中国中医科学院心血管病研究所(北京 100091)

王承龙，E-mail：wcl796@163.com

信息：闫会晶，刘剑刚，董瑞红，等.益气活血中药对急性心肌梗死后大鼠心肌线粒体生物合成相关蛋白的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志，2017，15(15)：1829-1833.

R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.15.005

1672-1349(2017)15-1829-05

2016-06-27)