芍药内酯苷对大鼠坐骨神经雪旺细胞的保护作用研究＊

王东超，魏颖，高佳琪，刘一冰，屈玲霞，刘永巧，徐暾海＊＊，刘铜华

芍药内酯苷对大鼠坐骨神经雪旺细胞的保护作用研究＊

王东超1,2,3，魏颖1,2,3，高佳琪1,2,3，刘一冰1，屈玲霞1,2,3，刘永巧1,2,3，徐暾海1,2,3＊＊，刘铜华2,3

（1.北京中医药大学中药学院北京100029；2.北京中医药大学中医养生学教育部重点实验室北京100029；3．北京中医药大学中医养生学北京市重点实验室北京100029）

目的：探讨糖痹康颗粒中主要成分芍药内酯苷对大鼠坐骨神经雪旺细胞（Schwann Cells，SCs）的影响作用。方法：本实验通过不同浓度的葡萄糖对大鼠坐骨神经雪旺细胞的影响的研究，建立了以150 mmol·L-1D-葡萄糖，培养时间为48 h的细胞氧化应激模型，通过设立芍药内酯苷高中低组（100 μM、20 μM、4 μM），模型组，维生素C组（100 μM），正常组，利用流式细胞仪定量检测细胞内ROS含量和荧光显微镜定性观察细胞内ROS状态以及CCK-8检测细胞活性。结果：采用CCK-8法检测细胞增殖情况，48 h后，模型组与正常组有明显的差异P＜0.01；芍药内酯苷给药组与模型组相比，P＜0.01；芍药内酯苷可以促进雪旺细胞增殖。通过检测ROS荧光含量，发现芍药内酯苷100、20、4 μM与模型组（Glu 150 mM）相比，各组P＜0.01，表明芍药内酯苷可以减轻雪旺细胞内ROS，缓解氧化应激状态。结论：芍药内酯苷可以通过增加雪旺细胞增殖，改善氧化应激状态对雪旺细胞产生保护作用。

糖痹康颗粒芍药内酯苷雪旺细胞神经保护

糖痹康颗粒（专利申请号：200810167551.1）主要由黄芪、桂枝、黄连、延胡索、鸡血藤、黄芩、女贞子、水蛭9味中药组成，具有益气养阴、解毒化瘀通络之功效，治疗糖尿病周围神经病变（Diabetic Peripheral Neuropathy，DPN）具有良好的临床效果[1-3]。雪旺细胞（SCs）是周围神经系统中有利于神经修复的主要神经胶质细胞，支持和保护轴突，维持着神经轴突的微环境，形成髓鞘，加速神经轴突的传导速度，对神经有营养作用，在周围神经损伤、再生和修复中，起着重要的作用。因此，SCs成为国内外研究周围神经病变的热点。本研究通过建立高糖诱导SCs致氧化应激模型，以维生素C为对照，利用流式细胞仪和荧光显微镜测定活性氧（ROS）含量，研究糖痹康颗粒中主要成分芍药内酯苷对氧化应激SCs模型的影响。

1 实验材料

1.1 主要仪器

Glomax multi酶标仪（美国promega公司），HERA cell 150i CO2孵育箱（美国Thermo scientific公司），IX71倒置显微镜（日本Olympus公司），Sigma台式高速低温冷冻离心机（美国Sigma-Aldrich公司），R200D型分析天平（德国赛多利斯集团）；HDL型超净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司）；流式细胞仪（美国BD公司）。

1.2 试药与试剂

雪旺细胞株CRL-2942TM（美国标准菌库，ATCC，马纳萨斯，维吉尼亚州）；维生素C（上海源叶生物科技有限公司，批号：S05J6G1，HPLC≥99%）；Gibco®高糖DMEM培养基（美国Invitrogen公司）；澳洲胎牛血清（FBS）（美国ORIGIN公司）；青霉素-链霉素混合液（北京博奥拓达科技有限公司）；胰蛋白酶-EDTA溶液（北京博奥拓达科技有限公司）；磷酸盐缓冲液（PBS）（北京博奥拓达科技有限公司）；cck-8（日本同仁化学研究所）；D（+）-无水葡萄糖（批号：S08J6G1，HPLC≥98%，上海源叶生物科技有限公司）；ROS试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司，批号：20161118）；96孔板，6孔板，细胞培养瓶（美国Fisher scientific公司）。

2 实验方法

2.1 高糖体外诱导Sc损伤模型的建立

在96孔板中加入100 μL的Sc细胞悬液（1× 105个/mL）。将培养板放在培养箱预培养24 h（37℃，5%CO2）；镜下观察细胞，汇合率达到80%以上，将培养板中的培养基吸出，分别加入葡萄糖浓度为50 mM、75 mM、100 mM、125 mM、150 mM、175 mM的DMEM培养基，加D-Glu进行配制；每组8个复孔，设置实验分组如下：①正常对照组：含细胞、含D-葡萄糖浓度为25 mM的DMEM培养基；②50 mM葡萄糖组：含细胞、含D-葡萄糖浓度为50 mM的DMEM培养基；③75 mM葡萄糖组：含细胞、含D-葡萄糖浓度为75 mM的DMEM培养基；④100 mM葡萄糖组：含细胞、含D-葡萄糖浓度为100 m MDMEM培养基；⑤125 mM葡萄糖组：含细胞、含D-葡萄糖浓度为125 m MDMEM培养基；⑥150 mM葡萄糖组：含细胞、含D-葡萄糖浓度为150 mMDMEM培养基；⑦175 mM葡萄糖组：含细胞、含D-葡萄糖浓度为175 mMDMEM培养基。

Sc细胞在不同浓度葡萄糖的DMEM培养基中进行培养，培养时间分为12、24、48、72、96 h；12、24、48、72、96 h后，向每个培养孔中加入10 μL CCK-8溶液，按照说明书进行OD值的检测。

2.2 实验分组

根据实验设计，分为以下几组：高药组：100 μM芍药内酯苷，150 mM葡萄糖DMEM完全培养基；中药组：20 μM芍药内酯苷，150 mM葡萄糖DMEM完全培养基；低药组：4 μM芍药内酯苷，150 mM葡萄糖DMEM完全培养基；模型组：150 mM葡萄糖DMEM完全培养基；阳性组：100 μM维生素C，150 mM葡萄糖DMEM完全培养基；正常组：正常25 mM葡萄糖的DMEM完全培养基。

2.3 芍药内酯苷治疗高糖损伤Sc细胞活性检测

在96孔板中加入100 μL的SCs细胞悬液（1× 105个/mL）。将培养板放在培养箱预培养24 h（37℃，5%CO2）。镜下观察细胞，汇合率达到80%以上，将培养板中的培养基吸出，每组10个复孔，按“2.2”项下实验分组。SCs细胞在不同药物浓度的DMEM培养基中进行培养48 h。48 h后，向每个培养孔中加入10 μL CCK-8溶液，按照说明书进行O.D值的检测。

2.4 芍药内酯苷治疗高糖损伤Sc细胞内ROS检测

2.4.1 荧光显微镜定性检测

在6孔板中加入2 mL的SCs细胞悬液（1× 105个/mL）。将培养板放在培养箱预培养24 h（37℃，5%CO2）。镜下观察细胞，汇合率达到80%以上，将培养板中的培养基吸出，每组3个复孔，按“2.2”项下实验分组。SCs细胞在不同药物浓度的DMEM培养基中进行培养48 h。按照ROS检测试剂盒说明书进行操作，用流式细胞仪检测。

2.4.2 流式细胞仪定量检测

在6孔板中加入2 mL的SCs细胞悬液（1× 105个/mL）。将培养板放在培养箱预培养24 h（37℃，5%CO2）。镜下观察细胞，汇合率达到80%以上，将培养板中的培养基吸出，每组3个复孔，按“2.2”项下实验分组。SCs细胞在不同药物浓度的DMEM培养基中进行培养48 h。按照ROS检测试剂盒说明书进行操作，用流式细胞仪检测。

3 结果

3.1 不同葡萄糖浓度的培养基对雪旺细胞增殖的影响

实验结果表明，细胞增殖与葡萄糖浓度成浓度依赖，随着葡萄糖浓度的增加细胞平均存活率逐渐降低，细胞增殖率降低。同一葡萄糖浓度，细胞增殖与时间呈负相关。通过表1可发现，浓度为175 mM葡萄糖在任何一个时间段均与正常组有显著的差别，P＜0.01，表明该浓度对雪旺细胞造成很大损伤，不能采用该浓度。而浓度为50 mM、75 mM的葡萄糖96 h前与正常组没有统计学差别（P＞0.05），表明这两个浓度在96 h前对雪旺细胞没有损伤。100 mM浓度的葡萄糖在72 h才有特别明显的细胞损伤（P＜0.01），125 mM、150 mM浓度的葡萄糖在48 h也有明显损伤（P＜0.01），为了增加氧化损伤程度，故选择150 mM，48 h作为模型条件[4,5]。

表1 不同葡萄糖浓度对雪旺细胞增殖影响的实验结果（xˉ,n=6）

表2 不同葡萄糖浓度下雪旺细胞平均存活率表/%

图1 不同葡萄糖浓度培养基对细胞平均存活率的影响

图2 AF干预雪旺细胞cck-8结果图

3.2 芍药内酯苷治疗高糖损伤雪旺细胞的活性检测

结果表明，如图2所示，48 h后，模型组与正常组有明显的差异（P＜0.01）；芍药内酯苷100、20、4 μM组与模型组相比，P＜0.01，表明各组均可促进雪旺细胞增殖，减少高糖对雪旺细胞的损伤作用且高浓度促进作用强于低浓度。

3.3 荧光显微镜观察SCs内ROS状态

通过荧光显微镜观察SCs细胞内ROS荧光状态，可直观观察到模型组荧光强度高于正常组，表明模型可用。同时，给药组各个荧光强度均弱于模型组，表明芍药内酯苷可以缓解SCs的氧化应激状态。

3.4 流式细胞仪检测SCs内ROS含量

如图所示，与正常组（Glu 25 mM）相比，各组P＜0.01；芍药内酯苷100、20、4 μM与模型组（Glu 150 mM（相比，各组P＜0.01，表明芍药内酯苷可以减轻雪旺细胞内ROS，缓解氧化应激状态。

4 讨论

DPN是常见的糖尿病慢性并发症之一，发病机制复杂，但是高血糖是发病机制的中心环节。高血糖时，细胞线粒体电子传递超负荷和血管内皮细胞还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶激活，使ROS产生过量，引起氧化应激反应，使促氧化与抗氧化失衡，造成细胞损伤。氧化应激在DPN中的作用：①神经细胞受损，由神经内膜产生的ROS对神经细胞具有直接毒性作用；②ROS作为一种信号分子，能够激活一系列的异常途径的信号通路，直接或者间接作用，引起细胞结构和功能紊乱，导致神经细胞受损坏死或者凋亡。在高糖环境下大鼠坐骨神经雪旺细胞p38丝裂素活化蛋白激酶（p38 MAPK）、肿瘤坏死因子-α和可溶性血管间内皮细胞黏附分子-1水平上调，降低SOD，增加ROS和MDA。而且高糖在其他方面也会影响神经细胞的正常功能。如Lipin-1在脂质的合成代谢及其基因表达方面占有重要角色，对骨骼肌、脂肪组织和外周神经细胞内的代谢平衡发挥调节作用，影响机体糖脂代谢[6,7]。Lipin-1缺失可导致胰岛素抵抗、外周神经病变、脂质代谢异常[8]，也可引起成熟的外周神经的神经外膜组成成分缺失，从而影响周围神经髓鞘的形成，导致神经传导速度减慢[9]。研究发现，高浓度葡萄糖可以降低体外培养的SCs增殖活性，促进细胞凋亡。在降低细胞增殖和促进细胞凋亡的同时，也伴随着Lipin-1蛋白水平的下降。NGF可以诱导神经递质合成，蛋白磷酸化，维持神经的正常功能，也是神经营养因子家族中最早发现的一类因子。当神经未受损伤时，雪旺细胞不会分泌NGF，但是当神经受损时，雪旺细胞就会分泌NGF，促进神经修复和增生[10]。研究发现，NGF蛋白与其受体水平的减少在高糖刺激所引起的外周神经损伤和修复过程中有重要作用[11]。雪旺细胞是由神经嵴细胞分化生成的胶质细胞，在神经损伤和修复的过程中具有重要的作用。

图3 SCs内ROS荧光状态

在本实验前期研究中，已通过CCK-8法检验芍药内酯苷对SCs的毒性范围是小于500 μM，并且高中低给药浓度已做过相关机制研究，所以最终选取100、20、4 μM，对细胞活性也无影响。通过实验结果表明，芍药内酯苷可以缓解SCs氧化应激状态，可能与芍药内酯苷可以降低细胞炎性因子TNF-α和IL-1β，抑制小神经胶质细胞的活性，减少激活的p38 MAPK信号通路的研究报道相关。

图4 各组荧光强度图

本实验通过不同浓度的葡萄糖对大鼠坐骨神经雪旺细胞的影响，建立了以150 mmol·L-1D-葡萄糖，培养时间为48 h的氧化应激模型，通过设立芍药内酯苷高中低组（100、20、4 μM），模型组，阳性药组（100 μM），正常组，利用流式细胞仪定量检测细胞内ROS含量和荧光显微镜定性观察细胞内ROS状态以及CCK-8检测细胞活性，结果表明芍药内酯苷可以改善雪旺细胞氧化应激状态，为糖痹康颗粒药效作用及机制研究奠定基础。

图5 ROS流式荧光图

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Study onAlbiflorinActivity in Protection of Schwann Cells in Rats’Sciatic Nerve

Wang Dongchao1,2,3,Wei Ying1,2,3,Gao Jiaqi1,2,3,Liu Yibing1,Qu Lingxia1,2,3, Liu Yongqiao1,2,3,Xu Tunhai1,2,3,Liu Tonghua2,3
(1.Collage of Chinese Medicine,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China; 2.Key Laboratory on Health Cultivation of the Ministry of Education,Beijing 100029,China; 3.Beijing Key Laboratory of Health Cultivation,Beijing 100029,China)

This paper was aimed to study the albiflorin activity of Tang-Bi-Kang(TBK)granules in protecting Schwann cells(SCs)of rat’s sciatic nerve.The establishment of SCs oxidative stress model was the condition of 150 mmol×L-1 D-glucose with different concentrations.And the incubation time was 48 h.The experiment groups were the high-dose, middle-dose and low-dose(100 μM,20 μM,4 μM)albiflorin group,the model group,the vitamin C(100 μM)group, and the normal group.Flow cytometry was used to detect the content of ROS in SCs.Fluorescence microscope was used to observe the condition of ROS fluorescence in SCs.And CCK-8 was used to detect the cell activity.The results showed that by using CCK-8 to detect cell proliferation,after 48 h,there was a significant difference between the model group and the normal group(P＜0.01);the albiflorin group compared with the model group(P＜0.01).It indicated that albiflorin can promote the proliferation of SCs.Detecting the ROS fluorescence content,it showed that compared with the model group(Glu 150 mM),the 100 μM,20 μM,and 4 μM albiflorin group,it was P＜0.01 for each group.It showed that albiflorin could relieve the ROS in SCs and alleviate oxidative stress.It was concluded that albiflorin can increase the proliferation of SCs and improve the state of oxidative stress with the protection of SCs.

Tang-Bi-Kang granules，albiflorin,Schwann cells,neuroprotection

10.11842/wst.2017.05.013

R285.5

A

（责任编辑：郭嫦娥，责任译审：王晶）

2017-04-17

修回日期：2017-05-20

＊科学技术部国家重大新药创制科技重大专项（2012ZX09102201-001）：治疗糖尿病周围神经病变药物糖痹康临床前研究，负责人：刘铜华；北京中医药大学创新团队—中医药干预糖尿病及其并发症研究团队（2011-CXTD-19），负责人：刘铜华。

＊＊通讯作者：徐暾海，教授，博士生导师，主要研究方向：中药活性成分及其质量控制研究。