腌菜中亚硝酸盐含量的测定

谢微，陈秋娟，何星存，罗杨合，朱东建

(1.贺州学院 食品科学与工程技术研究院，广西 贺州 542899；2.贺州学院 化学与生物工程学院，广西 贺州 542899)

腌菜中亚硝酸盐含量的测定

谢微1，陈秋娟2*，何星存1，罗杨合1，朱东建1

(1.贺州学院 食品科学与工程技术研究院，广西 贺州 542899；2.贺州学院 化学与生物工程学院，广西 贺州 542899)

以α-萘胺为显色剂，采用可见分光光度法，测定贺州市八步区几种腌菜中亚硝酸盐的含量。该方法的线性方程为A=1.4307C+0.0037，相关系数R2=0.9998，检测限为1.5 μg/L，亚硝酸盐回收率为94.78%～99.53%。结果显示：该方法线性较好，操作简便，精密度高，5个样品中亚硝酸盐的含量均没有超标。

可见分光光度法；腌菜；α-萘胺；亚硝酸盐

亚硝酸盐俗称工业用盐，是一种白色或微黄色的结晶或颗粒状粉末，无臭，味微咸涩，易潮解，并易溶于水、液氮，微溶于甲醇等有机溶剂。亚硝酸盐广泛存在于自然环境中，特别是存在于食物中，比如蔬菜、粮食、肉类、鱼类、蛋类都含有一定量的亚硝酸盐[1]。亚硝酸盐广泛应用于工业中，如可作防锈剂；在食品方面也有着广泛的应用，如在食品加工生产中，亚硝酸盐可以作为增色剂和防腐剂[2]。亚硝酸盐在工业和食品方面给人类带来了利益和方便，但亚硝酸盐也是一种强致癌的物质。长期食用含有亚硝酸盐的食物会使血液中血红蛋白携氧能力降低，从而引发组织缺氧，同时还可能会使血压降低，或者血管扩张[3]。另外，亚硝酸盐还能与胃中的含氮类物质发生作用转化成亚硝胺[4]。当体内的亚硝胺含量达到一定的量时，就可以引发胃癌、食管癌和肝癌等，对人体产生极大的危害[5]。

长期以来，由于腌菜能够长时间贮存，并且具有独特的风味而广受市民的喜爱，腌菜在市场上随处可见。研究表明：蔬菜是一种极易富集硝酸盐的食品，蔬菜在腌制过程中，由于微生物以及硝酸还原酶的作用，使得硝酸盐还原成亚硝酸盐[6]。因此，控制腌菜中的亚硝酸盐含量很有必要。

目前测定亚硝酸盐含量的方法有很多种，常用的方法是盐酸萘乙二胺分光光度法[7]、催化光度法[8]、离子色谱法[9]等，这些方法灵敏度较高，但操作复杂，并且反应条件需要严格控制，对环境因素也比较敏感。还有一些新兴的测定方法如催化动力学法[10]、胶束增效紫外分光光度法[11]、漫反射光谱法[12]等，这些方法测定亚硝酸盐精密度较高，但是操作复杂，并且仪器较大，价格高，测定时间也较长，不适合推广使用。

本次课题采用的是在弱酸的情况下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生反应产生重氮化合物，再与α-萘胺耦合，形成紫红色的偶氮化合物，测定其吸光度。本次测定广西贺州市八步区部分腌菜的亚硝酸盐含量，旨在给当地市民提供有价值的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

大头菜、榨菜、梅菜、腌萝卜：购于阳光市场；凉拌菜：购于泰兴超市。

亚硝酸钠、对氨基苯磺酸、α-萘胺、四硼酸钠、亚铁氰化钾、乙酸锌、盐酸、无水乙醇、氢氧化钠：以上药品均为分析纯；实验用水为超纯水。

TU-1901双光束紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；722可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；FA1004电子天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；101-1电热恒温鼓风干燥箱 上海跃进医疗器械厂；HHS电热恒温水浴锅 上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.2 试剂的配制

20% 盐酸溶液：量取54.8 mL 36.5%盐酸至100 mL烧杯中，加水至100 mL刻度线。

1 mg/mL亚硝酸钠标准储备溶液：准确称取0.5000 g 亚硝酸钠于100 mL烧杯中，先加入少量水溶解，转入500 mL容量瓶中，加水定容，摇匀，做储备液。

5 μg/mL亚硝酸钠标准工作溶液：量取5.00 mL 1 mg/mL亚硝酸钠标准溶液于1000 mL容量瓶中，加水定容，摇匀。

4 g/L对氨基苯磺酸溶液：称取2.000 g对氨基苯磺酸固体溶于500 mL 20%盐酸中，混匀，置于棕色瓶中，避光保存。

2 g/L α-萘胺溶液：准确称取0.5000 g α-萘胺固体，先用少量95%酒精溶解，转入250 mL容量瓶中，再用95% 酒精定容，摇匀。

硼砂饱和溶液：称取25 g四硼酸钠固体溶于500 mL温水中，冷却至室温。

0.25 mol/L亚铁氰化钾溶液：准确称取10.6190 g亚铁氰化钾固体，溶于水中并转入100 mL容量瓶中，加水定容，摇匀。

1 mol/L乙酸锌溶液：准确称取21.9000 g乙酸锌固体，加入3 mL冰醋酸，加水溶解，转入100 mL容量瓶中，加水定容，摇匀。

0.01 mol/L 氢氧化钠溶液：称取0.04 g 氢氧化钠固体于100 mL烧杯中，加水至100 mL刻度线，搅拌溶解。

1.3 样品处理

准确称取 2.5000 g 经粉碎均匀的腌菜样品，置于250 mL烧杯中，加入 12.5 mL硼砂饱和溶液，搅拌均匀，加入约100 mL 70 ℃左右的水，并在沸水浴中加热15 min，取出冷却到室温，转入250 mL容量瓶中，再加入5 mL亚铁氰化钾溶液和5 mL乙酸锌溶液以沉淀蛋白质，加水定容，加入1 g活性炭[13]，摇匀，静置，吸走上层脂肪并进行抽滤，滤液备用[14]。

1.4 实验方法

1.4.1 实验原理

样品经蛋白质沉淀、除去脂肪后，在弱酸的情况下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应生成重氮盐，重氮盐再与α-萘胺试剂发生耦合反应，生成紫红色偶氮化合物，亚硝酸盐特效试剂α-萘胺溶液作显色剂，能够成功地避免实验中其他阴阳离子的影响[15]。反应式如下：

反应1：

反应2：

1.4.2 标准曲线的绘制方法

分别吸取一定量的5 μg/mL亚硝酸钠标准溶液，置于50 mL容量瓶中，分别加入一定量的 4 g/L对氨基苯磺酸溶液，在一定的温度下，调节溶液的pH为5，摇匀，静置，再加入一定量的2 g/L α-萘胺溶液，加水至刻度，摇匀，静置，于1 cm比色皿中，在最大吸收波长处测定吸光度，以亚硝酸钠标准溶液浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。

1.4.3 样品的测定

吸取40 mL滤液置于50 mL容量瓶中，加入一定量的4 g/L对氨基苯磺酸溶液，在一定的温度下，调节溶液的pH，摇匀，静置，再加入一定量的2 g/L α-萘胺溶液，加水至刻度，摇匀，静置，于1 cm比色皿中，在最大吸收波长处测定吸光度。

2 结果与讨论

2.1 最大波长的确定

反应1：吸取5.00 mL 5 μg/mL亚硝酸钠标准溶液，置于50 mL容量瓶中，加入2.00 mL 4 g/L对氨基苯磺酸溶液，摇匀，静置3～5 min，加水至刻度，摇匀，于1 cm比色皿中，做光谱扫描，结果见图1。

反应2：吸取5.00 mL 5 μg/mL亚硝酸钠标准溶液，置于50 mL容量瓶中，加入2.00 mL 4 g/L对氨基苯磺酸溶液，摇匀，静置3～5 min，再加入2.00 mL 2 g/L α-萘胺溶液，加水至刻度，摇匀，静置15 min，于1 cm比色皿中，做光谱扫描，结果见图1。

图1 反应1和反应2的波长Fig.1 The wavelength of reaction 1 and reaction 2

由图1可知，反应1在紫外区267 nm处吸光度达到最大，而在可见区无吸收。反应2在可见区520 nm处吸光度达到最大，故选择267 nm和520 nm分别为反应1和反应2的最适宜测定波长，为了更好考察反应条件对反应体系的影响。

2.2 反应条件的确定

2.2.1 反应1的反应条件的确定

2.2.1.1 反应时间的影响

吸取5.00 mL 5 μg/mL亚硝酸钠标准溶液，置于50 mL容量瓶中，加入2.00 mL 4 g/L对氨基苯磺酸溶液，摇匀，静置时间分别是1，2，3，4，5，6 min，加水至刻度线，混匀，于1 cm比色皿中，在267 nm处测量吸光度。以反应时间t为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制曲线，见图2。

图2 反应时间的影响Fig.2 The influence of reaction time

由图2可知，随着反应时间的延长，体系的吸光度逐渐增大，当反应时间为4 min时，吸光度急剧增大；当反应到5 min时，吸光度达到最大值；当反应时间大于5 min后，吸光度急剧下降。表明在5 min时，反应已充分完成。因此，选择5 min为反应1的最佳反应时间。

2.2.1.2 反应温度的影响

吸取5.00 mL 5 μg/mL亚硝酸钠标准溶液，置于50 mL容量瓶中，加入2.00 mL 4 g/L对氨基苯磺酸溶液，摇匀，温度分别控制在10，15，20，25，30，35 ℃，静置5 min，加水至刻度线，混匀，于1 cm比色皿中，在267 nm处测量吸光度。以反应温度T为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制曲线，见图3。

图3 反应温度的影响Fig.3 The influence of reaction temperature

由图3可知，体系的吸光度随着温度的升高而增大，当温度升到25 ℃时，体系的吸光度达到最大，随后再升高温度，吸光度反而缓慢下降，而20～35 ℃之间的吸光度相差不大，较稳定。故选择25 ℃为反应1 的最佳温度。

2.2.1.3 反应pH的影响

吸取5.00 mL 5 μg/mL亚硝酸钠标准溶液，置于50 mL容量瓶中，加入2.00 mL 4 g/L对氨基苯磺酸溶液，调节pH为1，2，3，4，5，6，7，摇匀，温度控制在25 ℃，静置5 min，加水至刻度线，混匀，于1 cm比色皿中，在267 nm处测量吸光度。以溶液pH为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制曲线，见图4。

图4 反应pH的影响Fig.4 The influence of reaction pH

由图4可知，随着pH的增大，吸光度逐渐增大，当pH达到4时，吸光度急剧增大；当pH为5时，吸光度达到最大值；当反应pH>5时，吸光度急剧下降。表明pH为5时，反应已充分完成。因此，选择pH 5为反应1的最佳反应pH值。

2.2.1.4 显色剂用量的影响

吸取5.00 mL 5 μg/mL亚硝酸钠标准溶液，置于50 mL容量瓶中，加入2 mL 4 g/L对氨基苯磺酸溶液的量分别为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL，调节pH为5，温度控制在25 ℃，摇匀，静置时间为5 min，加水至刻度线，混匀，于1 cm比色皿中，在267 nm处测量吸光度。以显色剂用量V为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制曲线，见图5。

图5 显色剂用量的影响Fig.5 The influence of chromogenic agent dosage

由图5可知，随着显色剂用量的增加，吸光度逐渐增大，当显色剂用量为2.0 mL时，吸光度达到最大值，反应能够充分完成；当显色剂用量大于2.0 mL后，吸光度没有上升反而下降。因此，选择显色剂用量2.0 mL为反应1的最佳显色剂用量。

2.2.2 反应2的反应条件的确定

2.2.2.1 反应时间的影响

吸取5.00 mL 5 μg/mL亚硝酸钠标准溶液，置于50 mL容量瓶中，加入2.00 mL 4 g/L对氨基苯磺酸溶液，调节pH为5，摇匀，温度控制在25 ℃，静置时间为5 min，再加入2.00 mL 2 g/L α-萘胺溶液，加水至刻度，摇匀，静置时间分别为5，10，15，20，25，30 min，于1 cm比色皿中，在520 nm处测量吸光度。以反应时间t为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制曲线，见图6。

图6 反应时间的影响Fig.6 The influence of reaction time

由图6可知，随着反应时间的延长，吸光度缓慢增大，当反应时间为30 min时，吸光度达到最大值，反应能够充分完成；当反应时间继续延长时，吸光度没有上升反而下降。因此，选择30 min为反应2的最佳反应时间。

2.2.2.2 反应温度的影响

吸取5.00 mL 5 μg/mL亚硝酸钠标准溶液，置于50 mL容量瓶中，加入2.00 mL 4 g/L对氨基苯磺酸溶液，调节pH为5，摇匀，温度控制在25 ℃，静置5 min，加水至刻度，混匀，再加入2.00 mL 2 g/L α-萘胺溶液，加水至刻度，温度控制在10，15，20，25，30，35，40 ℃，摇匀，静置30 min，于1 cm比色皿中，在520 nm处测量吸光度。以温度T为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制曲线，见图7。

图7 反应温度的影响Fig.7 The influence of reaction temperature

由图7可知，吸光度随着温度的上升而增大，当温度达到20 ℃时，吸光度达到最大值，再升高温度，体系的吸光度反而下降，且25 ℃后的吸光度趋于稳定。故选择20 ℃为反应2 的最佳温度。

2.2.2.3 反应pH的影响

吸取5.00 mL 5 μg/mL亚硝酸钠标准溶液，置于50 mL容量瓶中，加入2.00 mL 4 g/L对氨基苯磺酸溶液，调节pH为5，摇匀，温度控制在25 ℃，静置5 min，再加入2.00 mL 2 g/L α-萘胺溶液，加水至刻度，控制pH为1，2，3，4，5，6，7，温度控制在20 ℃，静置30 min，于1 cm比色皿中，在520 nm处测量吸光度。以反应pH为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制曲线，见图8。

图8 反应pH的影响Fig.8 The influence of reaction pH

由图8可知，溶液的吸光度随pH的变化影响不大，且原溶液的pH值为4。因此，选择pH 4为反应2的最佳反应pH值。

2.2.2.4 显色剂用量的影响

吸取5.00 mL 5 μg/mL亚硝酸钠标准溶液，置于50 mL容量瓶中，加入2 mL 4 g/L对氨基苯磺酸溶液，调节pH为5，温度控制在25 ℃，摇匀，静置时间为5 min，再加入2 g/L α-萘胺溶液，用量分别为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL，加水至刻度，控制pH为4，温度控制在20 ℃，摇匀，静置30 min，于1 cm比色皿中，在520 nm处测量吸光度。以显色剂用量V为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制曲线，见图9。

图9 显色剂用量的影响Fig.9 The influence of chromogenic agent dosage

由图9可知，随着显色剂用量的增大，吸光度缓慢增大，显色剂用量为2.0 mL时，吸光度达到最大值，反应能够充分完成；当显色剂用量大于2.0 mL后，吸光度没有上升而是缓慢下降。因此，选择显色剂用量2.0 mL为反应2的最佳显色剂用量。

2.3 标准曲线的绘制

分别吸取0，0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00 mL5 μg/mL亚硝酸钠标准溶液，置于50 mL容量瓶中，分别加入2.0 mL 4 g/L对氨基苯磺酸溶液，调节pH为5，温度控制在25 ℃，摇匀，静置时间为5 min，再加入2.0 mL 2 g/L α-萘胺溶液，加水至刻度，温度控制在20 ℃，摇匀，静置30 min，于1 cm比色皿中，在520 nm处测定吸光度。以亚硝酸钠标准溶液浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线，见图10。

图10 标准曲线Fig.10 The standard curve

由标准曲线可知回归方程为A=1.4307C+0.0037，相关系数R2=0.9998，线性较好。

2.4 样品的测定

吸取40 mL滤液置于50 mL容量瓶中，加入2.0 mL4 g/L对氨基苯磺酸溶液，调节pH为5，温度控制在25 ℃，摇匀，静置时间为5 min，再加入2.0 mL 2 g/L α-萘胺溶液，加水至刻度，控制pH为4，温度控制在20 ℃，摇匀，静置30 min，于1 cm比色皿中，在520 nm处测定吸光度，平行5次。不同类型腌菜样品中亚硝酸盐含量测定的结果见表1。

表1 腌菜中亚硝酸盐含量测定结果Table 1 Determination results of nitrite content in pickles

由表1可知，不同的腌菜中亚硝酸盐的含量存在着较大的差异。在所测的5种腌菜中，亚硝酸盐含量最高的大头菜为4.9529 mg/kg，其次的榨菜、凉拌菜分别为4.4295，4.3082 mg/kg，含量最低的梅菜为0.6378 mg/kg。其中亚硝酸盐含量最低的梅菜和含量最高的大头菜，其含量相差8倍。腌制食品中的亚硝酸盐含量的国家标准为20 mg/kg[16]，由此可知，本次测量的腌菜样品中亚硝酸盐含量均没有超标。

2.5 检测限的确定

用水代替样品滤液在相同条件下测定吸光度，平行20次。以20次测定的试剂空白标准差的3倍表示该方法的检测限，为1.5 μg/L。

2.6 精密度试验

吸取5.0 mL 5 μg/mL亚硝酸钠标准溶液，置于50 mL容量瓶中，分别加入2.0 mL 4 g/L对氨基苯磺酸溶液，调节pH为5，温度控制在25 ℃，摇匀，静置时间为5 min，再加入2.0 mL 2 g/L α-萘胺溶液，加水至刻度，调节pH为4，温度控制在20 ℃，摇匀，静置30 min，于1 cm比色皿中，在520 nm处测定吸光度，平行5次。精密度试验测定的结果见表2。

表2 精密度试验测定结果Table 2 Determination results of precision test

由表2可知，通过重复测定标样7次，计算吸光度的重复性，得亚硝酸盐的相对标准偏差RSD为0.29%，小于2%，满足分析实验的精密度要求，说明该实验精密度良好。

2.7 回收率试验

取滤液2份,分别加入2.5，5.0 mL 5 μg/mL亚硝酸钠标准溶液，测定吸光度，平行3次。根据工作曲线计算出其含量，求回收率。以榨菜为例，其回收率试验测定的结果见表3。

表3 回收率试验结果Table 3 Results of recovery test

由表3可知，通过对2个不同加标量的分析，测得亚硝酸盐的回收率为97.99%～99.53%，平均回收率为98.48%，相对标准偏差RSD为0.43%。故该方法有较高的准确性和可靠性。

3 结论

分光光度法测定5种腌菜中的亚硝酸盐含量在0.6378～4.9529 mg/kg。所有样品均在国家标准范围之内，均不超标。贺州市八步区阳光市场部分腌菜可以放心食用。

本次实验法测定腌制蔬菜中亚硝酸盐含量是一个不错的选择，不仅设备简单、操作快捷，而且灵敏度高、结果准确，具有推广价值。

[1]吴颖珍,黄秋蝉.食品中亚硝酸盐的风险评估[J].畜牧与饲料科学,2009,30(5):62-63.

[2]于淼.食品中亚硝酸钠快速测定的新方法研究[D].齐齐哈尔:齐齐哈尔大学,2012.

[3]周蓓莉,肖进文,刘生峰,等.传统腌腊制品中亚硝酸盐的危害及其替代物的研究进展[J].中国食品添加剂,2012(2):166-171.

[4]史小康.浅谈亚硝酸盐及其危害[J].现代妇女,2013(12):15.

[5]朱雨霏.亚硝胺类化合物的致癌作用及预防[J].环境保护与循环经济,2008(5):34-35.

[6]罗雪华,蔡秀娟.紫外分光光度法测定蔬菜硝酸盐含量[J].华南热带农业大学学报,2004,10(1):13-15.

[7]姜薇薇,王树庆,张瑞菊,等.盐酸萘乙二胺法测定食品中亚硝酸盐含量的影响因素研究[J].山东商业职业技术学院学报,2011,11(3):87-89.

[8]朱克永.催化光度法测定食品中亚硝酸盐[J].四川食品与发酵,2011(3):53-56.

[9]王勇,左跃先,宋胜利,等.离子色谱法检验血液中的亚硝酸盐[J].中国无机分析化学,2013(1):80-82.

[10]张妮.一种测定香肠中亚硝酸盐含量的催化动力学新方法[J].化学工程师,2012(3):23-26.

[11]Nahid Pourreza,Mohammad Reza Fat'hi,Ali Hatami.Indirect cloud point extraction and spectrophotometric determination of nitrite in water and meat products[J].Microchemical Journal,2012,104:22-25.

[12]Vitor Hugo Marques Luiz,Leonardo Pezza,Helena Redigolo Pezza.Determination of nitrite in meat products and water using dapsone with combined spot test/diffuse reflectance on filter paper[J].Food Chemistry,2012,134(4):2546-2551.

[13]高毓嵘.维生素C对成品泡菜中亚硝酸盐含量的影响[J].中国调味品,2010,35(5):102-104.

[14]陈雅妮,任顺成,辛亚楠.蔬菜加工保藏过程中亚硝酸盐含量的变化[J].中国瓜菜,2013,26(2):18-20.

[15]丁旭光,张捷莉,刘志强,等.几种肉制品中亚硝酸盐含量的测定[J].食品科学,2004,25(10):276-279.

[16]张宝勇.六种腌制菜中亚硝酸盐含量及食用安全性评价研究[J].中国调味品,2012,37(9):96-98.

Determination of Nitrite Content in Pickles

XIE Wei1, CHEN Qiu-juan2*, HE Xing-cun1, LUO Yang-he1, ZHU Dong-jian1

(1.Research Institute of Food Science & Engineering Technology, Hezhou University,Hezhou 542899, China;2.School of Chemical and Biological Engineering,Hezhou University, Hezhou 542899, China)

The content of nitrite in pickles from Babu District of Hezhou City is determined by visible spectrophotometry with α-naphthylamine as chromogenic agent. The linear equation is A=1.4307C+0.0037, the correlation coefficient R2=0.9998, the detection limit is 1.5 μg/L, the recovery rate of nitrite is 94.78%～99.53%. The results show that the method exhibits good linearity, easy operation and high precision. The content of nitrite in five samples doesn't exceed the standard.

visible spectrophotometry；pickles；α-naphthylamine；nitrite

2017-02-16 *通讯作者

广西高校中青年教师基础能力提升项目(KY2016LX381)；广西高校科学技术研究项目(KY2015LX477)；贺州学院教学质量与教学改革工程项目(hzxyjg201636，hzxyjg201541)；贺州学院校级课题(2014ZC28)

谢微(1984-)，女，壮族，助理研究员，硕士，研究方向：分析检测；

陈秋娟(1983-)，女，讲师，研究方向：天然产物提取、纯化与分析。

TS255.53

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.08.025

1000-9973(2017)08-0114-06